PCV2類ISRE和Cap蛋白N-糖基化位點(diǎn)的生物學(xué)功能研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirusetype2，PCV2)是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的重要成員，它是閉合環(huán)狀的單鏈DNA病毒，無(wú)囊膜，基因組全長(zhǎng)1767bp或1768bp，采取滾環(huán)復(fù)制模式，它的三個(gè)主要開放閱讀框?yàn)镺RF1、ORF2和ORF3，ORF1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白R(shí)ep和Rep’，ORF2編碼核衣殼蛋白Cap，ORF3編碼的蛋白與細(xì)胞凋亡相關(guān)。PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweanmulti-systemw

2、astingsyndrome，PMWS)的主要病原，PMWS的主要表現(xiàn)為淋巴組織損傷和免疫功能的抑制，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。
　　免疫刺激能夠促進(jìn)PCV2在體內(nèi)的增殖并加劇臨床感染，一定量的豬α干擾素能夠在PK-15細(xì)胞上促進(jìn)PCV2的增殖，為了揭示這種現(xiàn)象是否與位于PCV2rep基因啟動(dòng)子區(qū)的類干擾素刺激反應(yīng)元件(interferon-stimulatedresponseelement，ISRE，nt1737-1751)

3、有關(guān)，我們構(gòu)建了類ISRE突變的PCV2病毒，將其與親本毒株在PK-15細(xì)胞上的復(fù)制效率、對(duì)豬α干擾素(poIFN-α)刺激的反應(yīng)和在豬體上的復(fù)制效率、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力進(jìn)行了比較，還用蟲熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)rep基因啟動(dòng)子活性及病毒ISRE生物學(xué)功能，為免疫刺激增強(qiáng)PCV2復(fù)制的現(xiàn)象提供理論基礎(chǔ)。
　　PCV2Cap蛋白第143-145位氨基酸(N143YS)存在一個(gè)保守的N-糖基化位點(diǎn)，PCV2能否利用這個(gè)糖基化位點(diǎn)改

4、變Cap蛋白的免疫原性成為本實(shí)驗(yàn)另一個(gè)研究重點(diǎn)，我們構(gòu)建了N-糖基化位點(diǎn)缺失與不缺失的Cap真核表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行了免疫特性測(cè)定，為揭示Cap蛋白N-糖基化位點(diǎn)生物學(xué)功能及開發(fā)PCV2DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　1.PCV2JSDT株感染性克隆的構(gòu)建、病毒拯救及類ISRE基因突變病毒的構(gòu)建
　　PCV2是PWMS的主要病原。本實(shí)驗(yàn)用PCR擴(kuò)增出分離到的江蘇東臺(tái)株(PCV2JSDT)的基因組全長(zhǎng)，利用EcoRⅠ酶切位點(diǎn)將病毒全基因克

5、隆入pUC18載體，得到pUC18-PCV2質(zhì)粒。大量制備重組質(zhì)粒后將病毒的全基因酶切下來(lái)并用T4連接酶體外環(huán)化后轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞構(gòu)建病毒感染性克隆并拯救出PCV2JSDT株。為了研究PCV2基因組中ISRE的生物學(xué)功能，本研究設(shè)計(jì)了突變引物并利用重組PCR技術(shù)將重組質(zhì)粒pUC18-PCV2中病毒基因組中的類ISRE進(jìn)行了定點(diǎn)突變，而后利用相同的感染性克隆方法拯救出類ISRE單點(diǎn)突變和多點(diǎn)突變的病毒。重組病毒由免疫過(guò)氧化物酶單層細(xì)胞實(shí)

6、驗(yàn)（IPMA）和基因測(cè)序進(jìn)行雙重鑒定，結(jié)果顯示病毒拯救成功，病毒基因組序列也與預(yù)期相符，并未出現(xiàn)基因突變。以上實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探索PCV2基因組中ISRE基序的生物學(xué)功能提供了技術(shù)平臺(tái)并鑒定了重要基礎(chǔ)。
　　2.PCV2rep基因啟動(dòng)子區(qū)類ISRE單點(diǎn)突變病毒的生物學(xué)特性研究
　　PCV2是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的動(dòng)物病原，適量的豬干擾素能促進(jìn)其在細(xì)胞中的增殖。為了揭示PCV2rep基因啟動(dòng)子區(qū)類ISRE在病毒中能否發(fā)揮生物學(xué)功能

7、，本研究對(duì)2株ISRE單點(diǎn)突變的重組PCV2病毒在PK-15細(xì)胞上的遺傳穩(wěn)定性、增殖特性及對(duì)poIFN-α刺激的反應(yīng)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，PCV2rep基因啟動(dòng)子區(qū)類ISRE單點(diǎn)突變后PCV2仍可在PK-15細(xì)胞中正常復(fù)制，但病毒滴度比親本毒株下降。PCV2G-Cmut在PK15細(xì)胞上3至10代之間遺傳穩(wěn)定，PCV2A-Tmut在PK-15細(xì)胞上第3代病毒保持突變基因的特征，但傳至第7代時(shí)-75和-74位的AC突變?yōu)門T，并一直保持

8、到第10代。100U/mL的PoIFN-α處理感染病毒的PK-15細(xì)胞后，親本毒株和2個(gè)突變毒株的陽(yáng)性感染細(xì)胞數(shù)量均有增加，但親本毒株病毒粒子數(shù)的增加顯著高于2個(gè)突變毒株。根據(jù)結(jié)果推測(cè)PCV2rep基因啟動(dòng)子區(qū)類ISRE的突變影響其啟動(dòng)子活性，并可能在干擾素促進(jìn)病毒增殖中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　3.PCV2rep基因啟動(dòng)子區(qū)類ISRE三點(diǎn)突變病毒的生物學(xué)特性研究
　　免疫刺激能夠增強(qiáng)PCV2的復(fù)制并引起宿主發(fā)病，poIFN-α能

9、增強(qiáng)PCV2在PK-15細(xì)胞上的增殖能力，這些現(xiàn)象都可能與PCV2基因組中的ISRE有密切關(guān)系。為了進(jìn)一步探索ISRE對(duì)于PCV2的作用，本研究將ISRE3點(diǎn)突變的重組病毒PCV2mut與親本毒株P(guān)CV2JSDT在體內(nèi)和體外進(jìn)行了一系列比較試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISRE3點(diǎn)突變后在PK-15細(xì)胞上的復(fù)制效率和對(duì)poIFN-α的反應(yīng)能力均顯著下降，而且PCV2mut在豬體內(nèi)的復(fù)制效率和刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的能力都比PCV2JSDT弱。這些試驗(yàn)證明不

10、管在體內(nèi)還是體外，類ISRE不僅影響著PCV2的復(fù)制效率，還是poIFN-α刺激PCV2增殖的重要元件，甚至影響著PCV2刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的能力。這些發(fā)現(xiàn)為免疫刺激能增強(qiáng)PCV2感染的現(xiàn)象提供了理論基礎(chǔ)，也推進(jìn)了對(duì)PCV2感染機(jī)體后宿主與病原之間相互作用復(fù)雜機(jī)制的理解。
　　4.PCV2含類ISRE的rep基因啟動(dòng)子活性分析及poIFN-α刺激對(duì)其活性的影響
　　PCV2基因組中的類ISRE位于rep基因啟動(dòng)子區(qū)，本實(shí)

11、驗(yàn)根據(jù)軟件預(yù)測(cè)的rep基因啟動(dòng)子上各類相關(guān)位點(diǎn)的分布情況將其分成5個(gè)不同的片段分別插入蟲熒光素酶報(bào)告基因啟動(dòng)子測(cè)試載體pGL-Basic中，構(gòu)成pGL-355、pGL-194、pGL-106、pGL-270、pGL-108等5個(gè)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性來(lái)衡量各啟動(dòng)子活性，發(fā)現(xiàn)rep基因啟動(dòng)子由兩個(gè)小啟動(dòng)子組成，其中一個(gè)包含1個(gè)ISRE基序，另一個(gè)則包含3個(gè)SP1位點(diǎn)，此結(jié)論又得到綠色熒光蛋白報(bào)告基因啟動(dòng)子活性測(cè)

12、試實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。為了進(jìn)一步探索類ISRE在rep啟動(dòng)子內(nèi)是否具有干擾素刺激反應(yīng)元件的功能，本實(shí)驗(yàn)將含類ISRE基序的啟動(dòng)子測(cè)試載體pGL-194和pGL-106轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，在100U/mLpoIFN-α的作用下轉(zhuǎn)錄活性分別提高了135％和220％，而無(wú)ISRE基序或ISRE基序發(fā)生突變的啟動(dòng)子測(cè)試載體則對(duì)poIFN-α刺激沒(méi)有反應(yīng)，說(shuō)明ISRE基序?qū)τ趐oIFN-α增強(qiáng)rep啟動(dòng)子活性的作用是必須的，類ISRE在rep啟動(dòng)子中具有

13、干擾素刺激反應(yīng)元件的功能。
　　5.獨(dú)立于PCV2基因組外的類ISRE對(duì)poIFN-α刺激的反應(yīng)
　　PCV2中類ISRE是否能獨(dú)立于病毒外單獨(dú)地產(chǎn)生生物學(xué)功能，本研究將ISRE、3個(gè)堿基突變的ISRE3個(gè)串聯(lián)后插入經(jīng)過(guò)改造的最小增強(qiáng)子測(cè)試載體pGL-mini中，構(gòu)成重組質(zhì)粒pGm-PCV2-ISRE(3)和pGm-PCV2-ISREm(3)，同時(shí)將GBP基因中的ISRE基序3個(gè)串聯(lián)后插入pGL-min中構(gòu)建陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pG

14、m-GBP-ISRE(3)。將pGL-mini、pGm-PCV2-ISRE(3)、pGm-PCV2-ISREm(3)和pGm-GBP-ISRE(3)同時(shí)轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，pGm-PCV2-ISRE(3)產(chǎn)生的熒光素酶活性是陰性對(duì)照的4倍，說(shuō)明PCV2類ISRE基序具有一定的增強(qiáng)子功能;在100U/mL的PoIFN-α處理的情況下，pGm-PCV2-ISRE(3)產(chǎn)生的熒光素酶活性是陰性對(duì)照的10倍，是不加PoIFN-α處理的2.5倍，

15、而PoIFN-α刺激對(duì)pGm-PCV2-ISREm(3)的熒光素酶活性并無(wú)多大影響，以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明PCV2基因組中的類ISRE確實(shí)能獨(dú)立于病毒外單獨(dú)地發(fā)揮干擾素刺激反應(yīng)元件功能。
　　6.PCV2Cap蛋白及其N-糖基化位點(diǎn)突變體的真核質(zhì)粒構(gòu)建。
　　PCV2的Cap蛋白是PCV2的主要免疫原，在Cap蛋白的143-145位氨基酸存在一個(gè)推定的N-連糖基化位點(diǎn)。為了驗(yàn)證此糖基化位點(diǎn)確實(shí)能使Cap蛋白糖基化，本實(shí)驗(yàn)將cap基因插

16、入pcDNA3真核表達(dá)載體中構(gòu)建成重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCap，并利用點(diǎn)突變?cè)噭┖袑⒅亟M質(zhì)粒中N-連糖基化位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，構(gòu)建成糖基化位點(diǎn)缺失的Cap蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒pCap-m;將pCap和pCap-m轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明兩者均能在真核細(xì)胞內(nèi)有效轉(zhuǎn)錄和表達(dá);表達(dá)的蛋白經(jīng)N-糖苷酶(PNGaseF)作用后western-blot分析顯示N-糖基化位點(diǎn)缺失質(zhì)粒pCap-m比pCap在PK-15細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白分子量小，說(shuō)

17、明此糖基化位點(diǎn)確實(shí)能使Cap蛋白糖基化。
　　7.PCV2Cap蛋白N-糖基化位點(diǎn)缺失對(duì)Balb/c小鼠的特異性免疫影響
　　為了評(píng)價(jià)N-糖基化位點(diǎn)對(duì)于PCV2Cap蛋白介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)的影響，將構(gòu)建的糖基化位點(diǎn)缺失與不缺失的Cap蛋白真核表達(dá)載體pCap-m、pCap作為DNA疫苗免疫Balb/c小鼠。將7-8周齡Balb/c小鼠平均分成4組，分別注射pCap、pCap-m、pcDNA3和PBS，共免疫3次，通過(guò)檢測(cè)抗

18、體水平、抗體亞型、淋巴細(xì)胞增殖情況、細(xì)胞因子水平和淋巴細(xì)胞亞型等免疫指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)Cap蛋白上N-多糖在誘導(dǎo)Cap特異性免疫反應(yīng)中的作用。結(jié)果表明，pCap-m誘導(dǎo)產(chǎn)生的Cap蛋白特異性T淋巴細(xì)胞增殖活性、CD8+T淋巴細(xì)胞百分比、IgG2a/IgG1比值以及IFN-γ水平都明顯高于pCap誘導(dǎo)產(chǎn)生的(P＜0.05)，這可能是糖基化位點(diǎn)缺失暴露了隱蔽的表位造成的。這些結(jié)果說(shuō)明在DNA疫苗免疫小鼠模型中，PCV2Cap蛋白N-糖基化位點(diǎn)的缺失