蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化高靈敏比色檢測分析及生物學(xué)功能研究.pdf

1、O-連接-N-乙酰葡萄糖胺（O-linked-N-acetyglucosamine，O-GlcNAc）糖基化是一種與磷酸化相似的、動態(tài)的、可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，由O-連接N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶（OGT）和O-連接N乙酰葡萄糖胺水解酶（OGA）協(xié)同完成。OGT負責(zé)將GlcNAc基團添加到蛋白質(zhì)的絲氨酸和蘇氨酸殘基上，OGA則將GlcNAc從蛋白質(zhì)上移除。O-GlcNAc修飾和傳統(tǒng)的糖基化不同，它主要發(fā)生在細胞核和細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)上，其糖

2、鏈結(jié)構(gòu)僅有一個氧糖苷鍵連接的N-乙酰葡萄糖胺單糖。在細胞內(nèi)O-GlcNAc修飾和磷酸化直接或間接地相互作用，參與細胞的蛋白酶解、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期調(diào)控等重要生命活動。近年來研究也表明，O-GlcNAc糖基化的異常與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、糖尿病等多種疾病密切相關(guān)。研究O-GlcNAc糖基化修飾在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)中都具有重要意義。針對目前O-GlcNAc糖基化修飾研究中的不足和空白，本文開發(fā)了一種基于銅沉積信號放大的

3、O-GlcNAc糖基化高靈敏比色檢測分析技術(shù)，同時應(yīng)用微陣列芯片技術(shù)研究了前列腺細胞中特定蛋白質(zhì)的O-GlcNAc糖基化，并進一步探討了OGA抑制劑對前列腺細胞增殖、遷移的影響。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴麥胚凝集素（WGA）用作O-GlcNAc的特異識別分子，進而通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)將膠體金顆粒（AuNP）引入到傳感器的表面。在還原劑抗壞血酸和硫酸銅存在的條件下，膠體金顆粒催化銅離子還原為銅并沉積于其表面，沉積銅的量與分析

4、物的濃度成比例。其中AuNP催化（代替昂貴而不穩(wěn)定的生物酶）的銅沉積能夠有效地放大檢測信號，形成超高的檢測靈敏度。在加入氯化鐵（FeCl3）后，沉積的銅被三價鐵離子（Fe3+）氧化成Cu2+，同時Fe3+被還原成亞鐵離子（Fe2+）。隨后，通過Fe2+和紅菲繞啉之間的配位產(chǎn)生紅色絡(luò)合物，引起溶液顏色的變化。因此，蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾的水平可以通過用肉眼直接進行定性評價，或通過測量紅色溶液的吸收值來定量檢測。⑵研究了前列腺癌細胞系（

5、PC-3）和正常前列腺細胞系（RWPE-1）的細胞裂解液中的總O-GlcNAc糖基化水平。結(jié)果表明：與正常細胞系RWPE-1相比，癌細胞系PC-3的總O-GlcNAc糖基化水平顯著升高，這與文獻報道的結(jié)果一致。⑶蛋白質(zhì)微陣列芯片的結(jié)果表明：癌細胞系PC-3中的O-GlcNAc糖基化修飾水平顯著高于正常細胞系RWPE-1中的水平，同時經(jīng)OGA抑制劑Thiamet G處理的PC-3、RWPE-1細胞的裂解液中O-GlcNAc修飾水平均高于未

6、處理細胞系，驗證了抑制OGA的活性能夠提高細胞內(nèi)總O-GlcNAc修飾水平。此外，與正常前列腺細胞RWPE-1相比，前列腺癌細胞PC-3中OGT表達水平升高，OGA的表達水平降低。這些結(jié)果也表明，O-GlcNAc或許是一個很好的腫瘤分子標志物，可能在前列腺癌的診斷和治療中起著重要作用。⑷研究了細胞裂解液中c-Myc、NF-κB、p53三種蛋白的表達及其O-GlcNAc修飾水平，其中涉及經(jīng)Thiamet G處理的PC-3、RWPE-1細胞

7、和未經(jīng)Thiamet G處理的PC-3、RWPE-1細胞。結(jié)果表明：與未經(jīng)處理的細胞相比，OGA抑制劑處理后的兩種細胞中的c-Myc、NF-κB蛋白O-GlcNAc糖基化修飾水平升高，而p53蛋白的O-GlcNAc糖基化修飾水平卻降低，這說明OGA抑制劑促進了c-Myc、NF-κB兩種蛋白的O-GlcNAc糖基化，抑制了p53蛋白的O-GlcNAc糖基化。并且與RWPE-1細胞系相比，PC-3細胞中c-Myc和p53的O-GlcNAc修