肺表面活性蛋白A基因突變對糖基化修飾及其生物學(xué)功能的影響.pdf

1、背景和目的：特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種致死性且病因不明的肺部疾病。肺表面活性蛋白A（SP-A）是一種在II型肺泡上皮細(xì)胞中合成并分泌到細(xì)胞外的糖基化蛋白，其在維持肺的固有免疫系統(tǒng)功能及肺表面活性物質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮較為重要的作用。通過對兩個家族性的肺纖維化群體病人進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了肺表面活性蛋白A2的兩個稀有突變（G231V和F198S)。這兩個位點的突變都會引起SP-A2唾液酸化修飾缺失并且導(dǎo)致蛋白不能被分泌到細(xì)胞外。唾液酸化修

2、飾發(fā)生在蛋白糖鏈的末端，其缺失會導(dǎo)致蛋白的不完全糖基化修飾進(jìn)而影響蛋白的生物學(xué)功能，但SP-A蛋白的糖基化修飾對該蛋白功能的影響卻很少有研究報道。本論文通過對不同類型突變引起的SP-A糖基化修飾缺陷研究對其生物學(xué)功能的影響以及可能的致病機(jī)理。
　　方法：我們利用野生型大鼠來源的SP-A通過點突變技術(shù)構(gòu)建兩種不同類型的突變載體：（1）糖基化修飾位點的直接突變（N21T、N207S和N21T/N207S）使得糖鏈不能加入到蛋白上；（2

3、）與肺纖維化疾病直接相關(guān)的糖識別結(jié)構(gòu)域（CRD）的突變（G231V和F198S）。我們把構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO-K1）中表達(dá)，通過蛋白質(zhì)印記技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、α-胰凝乳蛋白酶的消化作用等比較細(xì)胞內(nèi)合成及分泌到細(xì)胞外的野生型及不同突變型的鼠SP-A蛋白生化特性及功能的差異。
　　結(jié)果：CRD位點的兩個突變蛋白（G231V和F198S）都會完全破壞SP-A蛋白的分泌功能，而糖基化位點的突變蛋白（N21T、

4、N207S和N21T/N207S）仍可以分泌到細(xì)胞外。兩種類型的突變都會形成乙基苯基聚乙二醇（NP-40）不溶物而沉積在細(xì)胞內(nèi)，但卻只有主要聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的CRD突變蛋白形成的沉積才可以被化學(xué)分子伴侶物質(zhì)4-苯丁酸鈉（4PBA）所減少。另外，兩種突變蛋白都會導(dǎo)致其穩(wěn)定性的下降，并且CRD突變蛋白更易被α-胰凝乳蛋白酶降解。兩種NP-40可溶性的突變蛋白都是通過蛋白酶體途徑在細(xì)胞內(nèi)降解，而NP-40不溶的突變蛋白還可以通過溶酶體途徑降解。