氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PAT1糖基化修飾的功能研究.pdf

1、PAT1是一個(gè)在脊椎動(dòng)物中保守的跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要定位于溶酶體以及細(xì)胞表面，參與營養(yǎng)代謝和mTORC1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。以爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopus laevisoocyte)為表達(dá)系統(tǒng)，Dorn等人發(fā)現(xiàn)人源PAT1蛋白存在翻譯后的糖基化修飾，其修飾位點(diǎn)主要發(fā)生在PAT1蛋白朝向細(xì)胞外區(qū)域的三個(gè)天冬酰胺殘基上(N174，183，470)。進(jìn)一步的研究表明，糖基化修飾對(duì)于PAT1蛋白的穩(wěn)定性和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能沒有影響，但是糖基化位點(diǎn)突

2、變的PAT1蛋白(PAT13NQ)不能正確定位在爪蟾卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜上(Dornet al.2009a)。據(jù)此我們推測(cè)，PAT13NQ蛋白可能轉(zhuǎn)而主要定位于溶酶體。這種定位的改變將會(huì)進(jìn)一步降低溶酶體內(nèi)的氨基酸水平，并導(dǎo)致mTORC1活性的下降。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們使用來源于人胚腎的HEK293細(xì)胞，構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)糖基化位點(diǎn)突變的EGFP-PAT13NQ的細(xì)胞系。以該細(xì)胞系為模型，獲得了如下主要研究結(jié)果:
　　1.與過表達(dá)野生型E

3、GFP-PAT1的細(xì)胞相比較，在過表達(dá)EGFP-PAT13NQ的情況下，mTORC1活性不但沒有降低，反而略有升高;
　　2.翻譯后的EGFP-PAT13NQ蛋白不穩(wěn)定，主要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑（ERAD）被降解;
　　3.與野生型EGFP-PAT1相比，EGFP-PAT13NQ在溶酶體上的表達(dá)量下降，而在細(xì)胞膜上的表達(dá)量升高;這與mTORC1活性檢測(cè)結(jié)果一致。
　　以上結(jié)果說明，在HEK293細(xì)胞中，PAT1蛋