人類精漿糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、糖基化修飾，是人體內(nèi)蛋白質(zhì)最普遍的修飾方式之一。N聯(lián)糖基化修飾普遍存在于細(xì)胞外蛋白，比如體液蛋白、分泌蛋白、細(xì)胞膜蛋白等。精漿是精子（細(xì)胞）生存的外部環(huán)境，主要由睪丸和附屬性腺分泌，富含體液蛋白和分泌蛋白，據(jù)此推測精漿中應(yīng)該富含N聯(lián)糖基化修飾的蛋白質(zhì)。精漿樣本相對容易獲取，精漿中蛋白含量較血液和尿液更豐富，通過質(zhì)譜和其他檢測技術(shù)可以進(jìn)行定性和定量檢測。這都提示精漿N聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)有潛力作為男性生殖系統(tǒng)疾病的無創(chuàng)性診斷標(biāo)記物，有助于疾病的

2、早期篩查和輔助診斷。糖基化修飾對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響，可以通過糖與碳水化合物相互作用，調(diào)控細(xì)胞粘附與識別，參與細(xì)胞間，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用。精漿糖基化蛋白質(zhì)正是通過這些功能調(diào)控精子在女性生殖道的運(yùn)輸以及與卵子的結(jié)合。已知有為數(shù)不多的精漿蛋白被鑒定為N聯(lián)糖基化蛋白，例如PSA、Glycodelin S、FN1、SEMG等，研究發(fā)現(xiàn)這些蛋白不同程度參與了男性生殖功能。雖然精漿中糖基化蛋白有非常重要的功能和臨床意義，但我們對人類精

3、漿N聯(lián)糖基化蛋白質(zhì)整體構(gòu)成和功能的了解仍然有限，值得關(guān)注和開展研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：構(gòu)建了一個高度可信的人類精漿N聯(lián)糖基化修飾蛋白質(zhì)譜系。構(gòu)建糖基化蛋白質(zhì)譜系方法為運(yùn)用凝集素富集N聯(lián)糖基化肽段，然后使用糖肽酶切割富集肽段結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜掃描?？紤]到個體間糖基化蛋白質(zhì)可能存在差異，進(jìn)行了5次生物學(xué)重復(fù)鑒定（標(biāo)本均來源自正常生育人群且精液參數(shù)正常），結(jié)果表明正常人群精漿N-糖基化蛋白質(zhì)構(gòu)成大致相似。本次研究共鑒定到37

4、2個糖基化蛋白和720個糖基化位點。為了進(jìn)一步研究精漿中糖蛋白的功能，利用ToppGene軟件進(jìn)行GO與KEGG功能學(xué)分析。372個鑒定到的糖基化蛋白質(zhì)對應(yīng)到365個Entrez基因。精漿糖基化蛋白主要富集在細(xì)胞外區(qū)域（138基因）、溶酶體（76個基因）、細(xì)胞膜(61個基因)，其中43％（160個蛋白）是分泌蛋白，最顯著的生物進(jìn)程與細(xì)胞粘附有關(guān)（涉及78個基因），功能分析提示精漿糖基化蛋白質(zhì)可能調(diào)控精液凝固與液化，精子運(yùn)動與獲能，并參與

5、精卵識別與融合。比較本研究與已發(fā)表男性生殖系統(tǒng)生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，我們鑒定到的糖基化蛋白質(zhì)有11個是附睪特異性，10個是睪丸特異性，4個是精囊特異性，3個是前列腺特異性，提示這些糖基化蛋白可以作為生殖系統(tǒng)和不育癥的診斷標(biāo)記物。
　　第二部分：著重觀察精漿糖基化蛋白質(zhì)和生化指標(biāo)，精子參數(shù)對精子前向運(yùn)動的影響。研究發(fā)現(xiàn)弱精組較正常組的精子濃度（64.6±33.8 VS88.4±44.1）×106/ml，正常形態(tài)率(9.4±5.3 VS12

6、.9±5.6)％明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義，說明精子前向運(yùn)動與精子濃度和形態(tài)密切相關(guān)。精漿果糖濃度與精子前向運(yùn)動比例(r=0.21)，精子總活力(r=0.25)均呈正相關(guān)，有統(tǒng)計學(xué)意義。我們挑選4個精漿糖基化蛋白質(zhì)(LTF，F(xiàn)N1，SEMG2，WFDC2)進(jìn)行免疫印跡實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTF和精子前向運(yùn)動有相關(guān)性，精漿中LTF表達(dá)量在弱精組較正常組明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。LTF由精囊腺和前列腺分泌，提示附屬性腺分泌不足影響精子前