精索靜脈曲張不育患者精漿外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究.pdf

1、目的:
　　精索靜脈曲張已成為男性不育的主要原因之一，但其致男性不育的機(jī)制尚未闡明。建立正常人精漿外泌體蛋白譜為研究精索靜脈曲張不育患者精漿外泌體比較蛋白組學(xué)研究提供參考，初步描繪精漿外泌體相關(guān)蛋白在精索靜脈曲張致男性不育的潛在分子功能作用，發(fā)現(xiàn)潛在的精漿外泌體生物標(biāo)志物，并進(jìn)一步構(gòu)建精索靜脈曲張大鼠模型以期為研究精索靜脈曲張精漿外泌體差異蛋白致男性不育的相關(guān)分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.在南方醫(yī)院檢驗(yàn)中心收

2、集正常志愿者精液標(biāo)本18例，分別對12例精液標(biāo)本采用超高速差速離心和6例精液標(biāo)本采用PEG6000富集方法提取精漿外泌體，免疫印跡驗(yàn)證外泌體蛋白標(biāo)志物，納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)分析其粒徑大小，透射電鏡(TEM)觀察其形態(tài);
　　2.對12例超高速差速離心提取的精漿外泌體后進(jìn)行精漿外泌體蛋白質(zhì)譜分析，并用免疫印跡方法驗(yàn)證其鑒定蛋白的可靠性;
　　3.另外選取6例精索靜脈曲張不育患者和6例正常生育志愿者精液樣本為研究對象，基

3、于TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析其精漿外泌體差異蛋白表達(dá)譜，生物信息學(xué)基因本體(GO)分析差異蛋白的細(xì)胞定位，生物學(xué)過程，分子功能;
　　4.采用左側(cè)腎靜脈半縮窄法結(jié)合完全結(jié)扎精索靜脈各屬支構(gòu)建精索靜脈曲張大鼠模型，與傳統(tǒng)方法對比，探討銀夾新方法的可行性。
　　結(jié)果:
　　1.采用超高速差速離心和PEG6000富集方法的提取物均陽性表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD63，ALIX，TSG101等，TEM結(jié)果顯示其呈類圓形、橢圓形囊泡

4、形態(tài)，內(nèi)含電子致密物，NTA分析顯示其粒徑大小均在30-150nm;
　　2.正常人精漿外泌體蛋白譜總共鑒定了1474個(gè)蛋白，生理狀態(tài)下這些蛋白主要參與蛋白代謝、能量途徑、蛋白代謝、細(xì)胞生長/維持和轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)過程，并選取其中PHGDH，LGALS3BP，SEMG1，ACTB，ALIX，GAPDH蛋白驗(yàn)證其可靠性，結(jié)果與質(zhì)譜數(shù)據(jù)相一致;
　　3.精索靜脈曲張精漿外泌體差異蛋白表達(dá)譜總共鑒定了1457個(gè)蛋白，其中定量蛋白數(shù)為1

5、331個(gè)。與正常生育組相比，發(fā)現(xiàn)了精索靜脈曲張不育患者精漿外泌體差異蛋白175個(gè)，其中上調(diào)76個(gè)蛋白，下調(diào)99個(gè)蛋白。GO分析表明這些差異蛋白主要參與的“細(xì)胞生長/維持”、“能量途徑”、“代謝”、“轉(zhuǎn)運(yùn)”等生物學(xué)過程失調(diào)，這與精索靜脈曲張致男性不育密切相關(guān);
　　4.與假手術(shù)組相比，傳統(tǒng)組和銀夾組在手術(shù)8周后，其左側(cè)精索靜脈直徑均大于1mm，左側(cè)腎臟未見病理學(xué)改變，顯示模型成功。其中，傳統(tǒng)組中出現(xiàn)左腎靜脈撕破出血及左腎積水等并發(fā)癥

6、導(dǎo)致造模失敗3只，銀夾組銀夾滑脫1只，傳統(tǒng)組和銀夾組造模成功率分別為75％和87.5％。
　　結(jié)論:
　　1.PEG6000富集方法可作為提取和鑒定精漿外泌體的有效方法;
　　2.建立了正常人精漿外泌體蛋白表達(dá)譜，為男性生殖系統(tǒng)疾病等比較蛋白組學(xué)研究提供了參考基礎(chǔ);
　　3.初步描繪了精索靜脈曲張不育患者精漿外泌體蛋白表達(dá)譜，其差異蛋白主要表現(xiàn)為“細(xì)胞生長/維持”、“能量途徑”、“代謝”、“轉(zhuǎn)運(yùn)”等生物學(xué)過程失調(diào)