CD147分子N-糖基化修飾的功能研究及其在腫瘤進展中的意義.pdf

1、惡性腫瘤的一個普遍特征是細(xì)胞的糖基化修飾發(fā)生了顯著的變化。腫瘤細(xì)胞表面糖蛋白糖基化形式的改變，對腫瘤細(xì)胞的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程起重要作用。目前已證實，對腫瘤細(xì)胞膜特征糖鏈結(jié)構(gòu)變化規(guī)律及其調(diào)控機制的研究，具有重要的腫瘤臨床診斷和治療方面的價值。
　　CD147是一種廣泛表達于造血及非造血細(xì)胞系，分子量約為43-66kDa的跨膜糖蛋白，其廣泛表達以及與其他蛋白的相互作用使之能夠參與多種不同的生理病理過程，并與某些重要疾病如腫瘤、炎癥

2、等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CD147在多種腫瘤細(xì)胞、組織高表達。功能研究發(fā)現(xiàn)，其通過誘導(dǎo)周圍成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生多種基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs，包括MMP-1、MMP-2、MMP-9）降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。
　　高度的糖基化修飾是CD147分子的重要特征之一。大量研究結(jié)果表明，各種癌組織、細(xì)胞中，CD147分子普遍高表達，并伴隨高度的糖基化。CD147分子的糖基化修飾非常豐富，糖鏈約占總分子量的一半。目前的研

3、究表明，腫瘤細(xì)胞中 CD147的糖基化修飾對其誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌可能有重要意義，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是，現(xiàn)有的關(guān)于 CD147糖基化的研究還較少且并不深入。尤其是CD147分子腫瘤相關(guān)性糖基化修飾的結(jié)構(gòu)、發(fā)揮功能的糖基化位點、CD147的糖基化修飾在腫瘤進展中發(fā)揮功能的機制還有待進一步明確。研究CD147分子的N-糖基化修飾的組分及其功能，對基于靶向CD147分子的腫瘤診斷和治療具有重要意義。
　　本課題擬明確CD14

4、7蛋白 N-糖基化修飾的結(jié)構(gòu)特點；通過突變CD147的三個糖基化位點進行CD147糖基化的功能研究；對CD147的腫瘤相關(guān)性糖組分β1，6 N-乙酰胺基葡萄糖分支成分進行功能研究，闡明CD147的β1，6分支在腫瘤進展中的意義；揭示腫瘤細(xì)胞中，EGFR信號通路參與調(diào)節(jié)CD147分子的兩種糖基化形式（HG-CD147和LG-CD147）的轉(zhuǎn)變。
　　第一部分：人肺癌組織中天然 CD147蛋白的純化、鑒定及糖基化結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜解析。首先我

5、們從人的肺鱗癌組織中，免疫親和層析法純化天然的CD147蛋白。對純化的蛋白進行電泳和免疫印跡鑒定，并通過糖苷酶處理、凝集素印跡初步明確其糖基化修飾特點：根據(jù)分子量的不同，CD147主要有兩種糖基化形式（HG-CD147和LG-CD147），且均為N-糖基化修飾；CD147蛋白含有二分或三分形式的復(fù)雜型糖結(jié)構(gòu)；高糖基化形式的CD147含有腫瘤相關(guān)糖糖組分：β1，6 N-乙酰胺基葡萄糖分支。蛋白樣品凍干并送至美國佐治亞大學(xué)復(fù)合糖結(jié)構(gòu)研究中心

6、進行糖結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜解析，發(fā)現(xiàn) CD147的N-糖基化由一系列高甘露糖型和復(fù)雜糖型的寡聚糖組成，并且含有與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的糖成分：核心巖藻糖和唾液酸。
　　第二部分：肺癌組織中天然 CD147蛋白的寡聚狀態(tài)及其誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。通過比較肺癌組織中純化的天然 CD147真核蛋白和原核的非糖基化的CD147蛋白在溶液中的寡聚形式，我們發(fā)現(xiàn)真核的天然 CD147蛋白在溶液中完全以寡聚形式存在；而原核的非糖基化的CD147蛋白大部分

7、以單體形式存在，只有小部分可在溶液中形成寡聚體，提示糖基化修飾可能對維持 CD147分子的高級空間結(jié)構(gòu)起重要作用。進一步用明膠酶譜法比較真核 CD147蛋白和原核蛋白誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，發(fā)現(xiàn)真核 CD147蛋白能更有效的誘導(dǎo)MMPs的分泌。表明糖基化的真核CD147蛋白的高級空間構(gòu)象，對CD147誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性可能有重要意義。
　　第三部分：CD147糖基化位點突變的功能研究。通過定點突變 CD147的三個N-糖基

8、化位點（N44Q、N152Q、N186Q），我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)蛋白成熟的過程中，糖基化修飾對CD147蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正確折疊和向質(zhì)膜定位有重要意義。其中突變第二個糖基化位點(N152Q)后，顯著抑制其向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運，且N152Q-CD147滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的標(biāo)志蛋白表達增高。突變 CD147的糖基化位點能顯著抑制腫瘤細(xì)胞促進基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，降解基質(zhì)的功能。
　　第四部分：CD147的腫瘤相關(guān)性糖組分β1，6

9、 N-乙酰胺基葡萄糖分支的功能研究。β1，6 N-乙酰胺基葡萄糖(GlcNAc)分支的寡聚糖,是UDP-乙酰氨基葡萄糖α-甘露糖β1–6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(糖基轉(zhuǎn)移酶V，GnT-V)催化形成的產(chǎn)物,大量研究結(jié)果表明，這種分支結(jié)構(gòu)是參與腫瘤轉(zhuǎn)移和惡性轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵糖結(jié)構(gòu)。通過構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染糖基轉(zhuǎn)移酶 V的肝癌細(xì)胞株，我們發(fā)現(xiàn)過表達GnT-V能夠使質(zhì)膜上和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中的CD147增多，從而CD147誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的活性增強，而

10、抑制β1，6分支形成的苦馬豆堿能夠抑制這一過程。
　　第五部分：EGFR信號通路對CD147糖基化的調(diào)節(jié)作用。我們發(fā)現(xiàn)表皮生長因子（EGF）和雙調(diào)蛋白(AR)作用于肝癌細(xì)胞株，短時間內(nèi)能夠促進CD147基因和蛋白水平的表達；而 EGFR信號通路的抑制劑 PD153035和ZD1839能夠抑制CD147的糖基化水平，隨著作用時間的延長，HG-CD147減少而LG-CD147增多，同時，CD147的細(xì)胞定位發(fā)生變化，EGFR信號通路的

11、抑制劑PD153035和ZD1839導(dǎo)致CD147在胞內(nèi)聚集而質(zhì)膜上的CD147減少。
　　綜上所述，本研究對CD147分子糖基化修飾的結(jié)構(gòu)進行鑒定和功能研究，明確了CD147蛋白N-糖基化的結(jié)構(gòu)特點和腫瘤相關(guān)性糖組分，揭示了糖基化修飾可能參與調(diào)節(jié) CD147分子的胞內(nèi)成熟、質(zhì)膜轉(zhuǎn)運過程及其寡聚狀態(tài)，并可影響 CD147誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的活性。本研究從糖基化修飾的角度，闡明腫瘤相關(guān)抗原 CD147分子促進腫瘤發(fā)展的機制，為基于