小鼠CD147糖基化位點(diǎn)突變體在小鼠肝細(xì)胞IAR20中的表達(dá)與生物學(xué)功能初步研究.pdf

1、目的： 蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾，它參與和調(diào)控生物體的許多生命活動(dòng)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)糖基化研究越來(lái)越受到廣泛的重視。 CD147是高度糖基化的跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的成員。CD147是細(xì)胞表面多功能糖蛋白，廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞中，如淋巴母細(xì)胞，炎癥細(xì)胞，特別在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)。CD147主要通過(guò)誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶活性參與組織重構(gòu)，參與許多生理和病理過(guò)程，包括精子發(fā)生、受精、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成

2、和發(fā)育、HIV感染和腫瘤轉(zhuǎn)移。 CD147由2個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域，1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。從CD147N端起，第一個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域與MMPs誘導(dǎo)活性及CD147自身寡聚有關(guān)；第二個(gè)胞外Ig結(jié)構(gòu)域與窖蛋白（Caveolin-1，Cav-1）存在相互作用。由于N-糖基化不同，CD147同時(shí)表現(xiàn)為高糖型CD147（HG-CD147，分子量40-66kDa）和低糖型CD147（LG-CD147，分子量32kDa）。有文獻(xiàn)報(bào)道，

3、N-糖基化對(duì)CD147的誘導(dǎo)活性起促進(jìn)作用，但CD147糖基化的功能尚有待深入研究。 本文基于本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的野生型CD147真核表達(dá)載體，利用快速PCR定點(diǎn)突變的方法，構(gòu)建CD147糖基化位點(diǎn)突變的真核表達(dá)載體，并將其穩(wěn)定表達(dá)于小鼠肝正常細(xì)胞IAR20中，觀察CD147的糖基化對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。 方法： 1．利用快速PCR定點(diǎn)突變的方法，構(gòu)建CD147糖基化位點(diǎn)突變pcDNA3．1表達(dá)載體。 2

4、．利用脂質(zhì)體將野生型CD147及其糖基化位點(diǎn)突變體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至小鼠肝正常細(xì)胞IAR20細(xì)胞上，以空表達(dá)載體做對(duì)照，經(jīng)G418篩選及RT-PCR和Western blot分析，獲得野生型CD147及其糖基化位點(diǎn)突變體穩(wěn)定表達(dá)株。 3．利用MTT法檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)野生型CD147及其糖基化位點(diǎn)突變體對(duì)IAR20細(xì)胞增殖能力的影響；利用體外基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn)，觀察檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)野生型CD147及其糖基化位點(diǎn)突變體對(duì)IAR20細(xì)胞遷移和侵襲能力的

5、影響。 結(jié)果： 1、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序鑒定表明，成功構(gòu)建小鼠CD147糖基化位點(diǎn)突變真核表達(dá)載體pcDNA3．1/CD147 （N154Q）和pcDNA3．1/CD147 （N44，154Q）。 2、Western blot和RT-PCR結(jié)果表明，pcDNA3．1/CD147WT，pcDNA3．1/CD147N154Q和pcDNA3．1/CD147N44，190Q在小鼠肝正常細(xì)胞IAR20細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)

6、野生型CD147和糖基化位點(diǎn)突變體CD147N154Q的分子量分別為44kDa和45kDa，糖基化位點(diǎn)突變體CD147N44，190Q表達(dá)為兩條帶，分子量分別為37kDa和42kDa。 3、與轉(zhuǎn)染空載體和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)野生型CD147和糖基化位點(diǎn)突變體CD147N154Q的IAR20細(xì)胞增殖能力和遷移能力顯著增強(qiáng)（p<0．05），而穩(wěn)定表達(dá)糖基化位點(diǎn)突變體CD147（N44，190Q）對(duì)IAR20細(xì)胞的增殖能力和遷移能