Foxp3突變體相關(guān)融合蛋白的表達(dá)、純化、鑒定及生物學(xué)功能的初步研究.pdf

1、Foxp3是FOX(forkhead box)家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)的特異性標(biāo)志，同時(shí)對(duì)Treg的發(fā)生、發(fā)育、功能的維持與發(fā)揮等方面起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)外源性Foxp3可使非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有類(lèi)似調(diào)節(jié)性T細(xì)胞樣的表型及免疫抑制功能。Foxp3的突變可能導(dǎo)致調(diào)節(jié)性的CD4+CD25+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受缺陷。
　　 HIV-1(humanimmunodeficie

2、ncy virus type1)基因編碼的反式激活蛋白( transactivator，TAT)中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)能夠攜帶外源性蛋白穿入幾乎所有的真核細(xì)胞膜而進(jìn)入細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，同時(shí)具有高效、快速的特點(diǎn)。
　　 目的：構(gòu)建帶HIV-1穿膜序列原核表達(dá)載體pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGF

3、P-Foxp3，表達(dá)并純化小鼠PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白，研究融合蛋白導(dǎo)入細(xì)胞的效率及其對(duì)T細(xì)胞活化增殖的免疫調(diào)節(jié)功能的影響。
　　 方法：利用基因重組技術(shù)構(gòu)建pET28a-PTD-△Foxp3、pET28aPTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3原核表達(dá)載體，并在大腸埃希菌Rosetta(DE3)中表達(dá)融合蛋白，經(jīng)Ni2+分離柱純

4、化融合蛋白。Western-blot技術(shù)檢測(cè)融合蛋白表達(dá)的正確性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合蛋白穿越細(xì)胞膜進(jìn)入小鼠T淋巴細(xì)胞瘤株EL-4細(xì)胞中的能力，并通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)初步分析融合蛋白對(duì)T細(xì)胞活化增殖的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建了pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白表達(dá)載體，表達(dá)并純化了PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3

5、、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)表達(dá)的融合蛋白均能高效的轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)；同時(shí)經(jīng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)初步表明PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能明顯抑制T淋巴細(xì)胞的活化增殖能力，而PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3突變體融合蛋白抑制T細(xì)胞活化增殖的能力喪失。
　　 結(jié)論：成功表達(dá)具有生物學(xué)活性的PTD-△Foxp3、PTD-eGFP△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白，為進(jìn)一