重組PTD-SARA融合蛋白生物學功能的初步研究.pdf

1、促進腎臟纖維化的關鍵因素之一被公認為是轉化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）和它下游的smad2和smad3依賴的信號轉導通路，Smads蛋白是TGF-β1家族信號從受體到核的細胞內轉導分子，TGF-β1同啟動素受體樣激酶5（Activin receptor like kinase 5，ALK5）結合，激發(fā)smad2和smad3發(fā)生磷酸化，之后與smad4結合并轉位入核，促進TGF

2、-β1反應性基因轉錄而致腎臟纖維化。SARA起初是作為Smad2結合蛋白被發(fā)現的，它通過兩個FYVE鋅指作用域定位于早期內漿膜，其可與I型TGF-β受體結合，募集Smad2或Smad3到I型TGF-β受體進行磷酸化，Smad2和Smad3磷酸化后就被SARA釋放，同Smad4裝配形成了Smad2/Smad4復合物及Smad3/Smad4復合物，即腎臟纖維化的基礎。SARA包含一C-末端和一Smad結合域（稱SARA肽適體），后者在體外能

3、與Smad2、Smad3結合，在受體活化后分離，Smad結合域中存在SmadMH2的疏水溝，其與3個結構基序結合，可選擇性與單體Smad結合并在體外阻止Smad3/Smad4形成復合物，進而阻止組織纖維化，故SARA肽適體預防和治療腎臟纖維化將會有廣闊的前景，但smad2/smad3和SARA間的作用發(fā)生在細胞內，SARA肽適體只有高效地進入細胞才可充分發(fā)揮其生物學活性，由于其分子量過大，無法用于生物體內治療。蛋白轉導結構域(Prote

4、in transduction domain,PTD)是近年發(fā)現的有穿細胞膜功能的一段多肽，能引導多肽或蛋白質快速有效地進入細胞內。所以我們利用PTD將與其共價結合的SARA肽適體通過非受體依賴、非轉運蛋白依賴、非能量依賴方式運送至細胞內技術，從而發(fā)揮其生物學作用。重組PTD-SARA融合蛋白前期已由我科室成功合成并保存。本實驗將利用基因工程技術制備SARA蛋白，作為研究重組PTD-SARA融合蛋白生物學功能實驗的對照組；檢測重組PTD

5、-SARA融合蛋白的穿膜作用，并在細胞實驗中通過比較重組PTD-SARA融合蛋白和SARA蛋白抑制TGF-β1誘發(fā)的腎臟上皮細胞向間質細胞轉分化作用，對重組PTD-SARA融合蛋白生物學功能進行初步的探索性研究，為臨床防治腎臟纖維化提供新的依據。
　　實驗一：SARA蛋白的克隆、表達、純化及鑒定
　　目的：構建質粒pQE-30-SARA，對其進行表達、純化、復性和鑒定。方法：使用大腸桿菌偏愛密碼子合成SARA全長基因，并對該

6、基因序列進行優(yōu)化設計。將其克隆入載體pQE-30，構建質粒pQE-30-SARA，并在大腸桿菌M15中誘導其表達，以Ni2+-NTA親和層析柱純化SARA蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及免疫印跡（Western blot）方法鑒定，4℃PBS溶液中進行透析復性。結果：成功地構建了PQE-30-SARA蛋白表達載體，并對其進行表達、純化及復性。結論：成功表達了具有生物學活性的SARA蛋白。SARA蛋白作為重組PTD-SARA

7、融合蛋白生物學功能初步研究實驗的對照組，為該實驗奠定了基礎。
　　實驗二：重組PTD-SARA融合蛋白生物學功能初步研究
　　目的：研究重組PTD-SARA融合蛋白抗纖維化的生物學功能。方法：免疫細胞化學法檢測重組PTD-SARA融合蛋白的穿膜作用；通過人腎小管近端上皮細胞（HK2細胞）形態(tài)學變化，免疫印跡法（Western blot）測定上皮細胞鈣粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth mus

8、cle actin,α-SMA）和磷酸化Smad3（PhosphoSmad3）蛋白水平以觀測重組PTD-SARA融合蛋白抑制轉化生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘發(fā)的腎小管上皮細胞向間質細胞轉分化作用。結果：重組PTD-SARA融合蛋白可高效地轉入細胞胞質與胞核。實驗組PTD-SARA融合蛋白與對照組SARA蛋白相比，PTD-SARA融合蛋白能更顯著上調E-cadherin蛋白，

9、下調α-SMA和磷酸化Smad3蛋白水平，實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：重組PTD-SARA融合蛋白可以高效地進入細胞胞質及胞核，與SARA蛋白相比，重組PTD-SARA融合蛋白能明顯地抑制TGF-β1誘發(fā)的腎小管上皮細胞向間質細胞轉分化作用。本研究為進一步研究重組PTD-SARA融合蛋白防治腎臟纖維化奠定了基礎。
　　結論：
　　1.成功表達了具有生物學活性的SARA蛋白，作為研究重組PTD-S