PTD-Foxp3融合蛋白體外功能的初步研究.pdf

1、Foxp3是FOX(forkhead box)家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)的特異性標(biāo)志，同時在Treg的發(fā)生、發(fā)育、功能的維持與發(fā)揮方面起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)外源性Foxp3可使非Treg細(xì)胞具有類似Treg細(xì)胞樣的表型及免疫抑制功能。
　　 人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type1，HIV-1)基因編碼的反式激活蛋白

2、(Trans-activator transcription，TAT)中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)能夠高效、快速地攜帶外源性蛋白穿入幾乎所有的真核細(xì)胞，而進(jìn)入細(xì)胞漿。由于其具有核定位信號，因此也能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。同時PTD具有不影響其攜帶的目的蛋白功能的特點。
　　 目的：我們的研究是要利用生物大分子載體工具蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)將Foxp3蛋白帶到細(xì)胞內(nèi)，以獲取大量的免疫

3、抑制細(xì)胞，從而突破Treg制約基礎(chǔ)和臨床器官移植的研究瓶頸，為最終應(yīng)用于器官移植和自身免疫性疾病治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：流式細(xì)胞術(shù)檢測PTD融合蛋白穿過細(xì)胞膜進(jìn)入EL-4細(xì)胞中的能力和量效關(guān)系；Western Blot分析和激光共聚焦顯微鏡觀察確認(rèn)融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞漿和細(xì)胞核；采用CCK-8法檢測融合蛋白對DO11.10鼠的CD4+CD25-T細(xì)胞活化增殖的影響，以及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+CD25-T細(xì)胞對效應(yīng)細(xì)胞的增殖抑制能力；

4、RT-PCR檢測IL-2、INF-γ、IL-10、TGF-B和CTLA-4的mRNA表達(dá)水平；ELISA測定上清中IL-2、INF-γ、IL-10和TGF-B的分泌水平。
　　 結(jié)果：通過流式細(xì)胞術(shù)分析證實表達(dá)的PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能高效的轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)；經(jīng)Western Blot和激光共聚焦顯微鏡觀察確認(rèn)PTD-Foxp3和PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能夠進(jìn)入細(xì)胞漿和細(xì)胞核；同時經(jīng)細(xì)胞增殖抑制實驗證明PTD

5、-Foxp3融合蛋白能明顯抑制OVA特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠DO11.10小鼠來源的CD4+CD25-T細(xì)胞的活化增殖能力，并且PTD-Foxp3轉(zhuǎn)導(dǎo)的DO11.10小鼠CD4+CD25-T細(xì)胞也有抑制細(xì)胞活化的能力；RT-PCR和ELISA結(jié)果可以看出PTD-Foxp3與Foxp3、PTD-eGFP相比可以明顯的抑制效應(yīng)細(xì)胞分泌的IL-2、IFN-γ，并促進(jìn)抑制性因子IL-10的產(chǎn)生；RT-PCR檢測PTD-Foxp3轉(zhuǎn)導(dǎo)的DO11.1