雞球蟲四種重組蛋白體外雞外周血單個(gè)核細(xì)胞功能的影響.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是近年來限制養(yǎng)雞業(yè)集約化發(fā)展的一類由艾美爾屬(Eimeria)的9種球蟲引起的寄生蟲病。該病主要以腸道病變?yōu)橹?，可引起雞消瘦、腹瀉、拉血便，嚴(yán)重的可引起動(dòng)物死亡，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，各種抗球蟲藥物的使用依然是防治該病的主要措施，但是蟲株對(duì)于藥物的耐藥性，以及對(duì)于禽類食品安全問題的的重視，人們開始尋找能夠有效防治球蟲病的方法。疫苗免疫不存在藥物殘留問題，而且安全高效。近幾年，雞球蟲病的各種

2、疫苗研究已逐漸引起研究人員的重視，并取得了一定的成果。
　　正確的認(rèn)識(shí)和掌握雞球蟲的生物學(xué)特性和抗雞球蟲的免疫保護(hù)機(jī)制，成為尋找更好的免疫保護(hù)抗原，研制免疫保護(hù)力強(qiáng)的雞球蟲病疫苗的重要前提，也是防治球蟲病的的重要理論依據(jù)。
　　本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)從幾種雞球蟲中獲得多種抗原基因，，并成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上選取雞堆型艾美爾球蟲抗原3-1E、巨型艾美爾球蟲抗原EM6、EM8和堆型艾美爾球蟲抗原MIF進(jìn)行了了重組表達(dá)，進(jìn)而研

3、究這四種重組蛋白體外對(duì)雞外周血單個(gè)核細(xì)胞多種功能的影響。
　　1.雞球蟲四種蛋白的表達(dá)及體外與雞外周血單個(gè)核細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組質(zhì)粒，表達(dá)純化3-1E、EM6、EM8和MIF四種重組蛋白，無菌采集雞抗凝血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，將重組蛋白以5μg/mL的濃度加入細(xì)胞懸液中，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h后收集細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光抗體技術(shù)，激光共聚焦顯微鏡下觀察檢測發(fā)現(xiàn)重組蛋白EM8和MIF能夠與雞外周血單個(gè)核細(xì)胞

4、結(jié)合，其余兩種蛋白沒有結(jié)合。
　　2.雞四種重組蛋白對(duì)雞外周血單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響
　　根據(jù)GenBank中雞IL-4、IL-17、IFN-γ和TGF-β的序列登錄號(hào)設(shè)計(jì)合成符合熒光定量試驗(yàn)的PCR引物探針。以GAPDH為內(nèi)參，用3-1E、EM6、EM8和MIF四種重組蛋白按濃度梯度分別刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞后收集細(xì)胞提取RNA后合成cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量檢測試驗(yàn)，分析細(xì)胞在不同濃度重組蛋白刺激后的細(xì)胞因子的 m

5、RNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組蛋白刺激單核細(xì)胞后，細(xì)胞因子IL4、IL/17D、IFN-γ和TGF-β4均有不同程度的變化，其中四組實(shí)驗(yàn)組的INF-γ的變化均比較顯著(p＜0.05);另外，重組蛋白EM6、EM8可比較顯著的引起四種細(xì)胞因子變化(p＜0.05)。
　　3.雞球蟲四種重組蛋白對(duì)鳩外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響
　　為了檢測3-1E、EM6、EM8和MIF對(duì)雞外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖作用，將不同濃度的重組蛋白分別與細(xì)胞

6、共培養(yǎng)24小時(shí)后，利用CCK-8法檢測增殖效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四種重組蛋白對(duì)細(xì)胞具有一定的刺激其增殖的作用。且在一定濃度下增殖情況比對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，其中重組蛋白EM8和MIF在幾個(gè)濃度梯度下的增殖情況均極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　4.雞球蟲四種重組蛋白對(duì)雞巨噬細(xì)胞吞噬功能和分泌NO的影響
　　為了檢測重組蛋白3-1E、EM6、EM8和MIF對(duì)雞的巨噬細(xì)胞功能的影響，本試驗(yàn)檢測了巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能

7、力，并測定了不同濃度重組蛋白作用巨噬細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛋白EM8和MIF均能夠使巨噬細(xì)胞的吞噬功能和NO分泌功能增強(qiáng)，而其余重組蛋白產(chǎn)生效果并不明顯
　　5.重組蛋白EM8和MIF對(duì)雞外周血T細(xì)胞和單核細(xì)胞的不同調(diào)節(jié)作用
　　外周血單個(gè)核細(xì)胞有兩個(gè)主要的亞群單核細(xì)胞和T細(xì)胞，它們在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用。不同的蛋白分子對(duì)不同類型的細(xì)胞具有多種不同的調(diào)節(jié)作用。在本試驗(yàn)中，我們研究了重