大片吸蟲(chóng)兩種排泄分泌蛋白的克隆、表達(dá)及其對(duì)山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞功能影響的研究.pdf

1、片形吸蟲(chóng)病(Fascioliasis)是由大片吸蟲(chóng)和肝片吸蟲(chóng)感染而引起的一種人獸共患寄生蟲(chóng)病。據(jù)估計(jì)，全球每年由于片形吸蟲(chóng)病造成的損失超過(guò)30億美元。此外，片形吸蟲(chóng)病已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為被忽視的熱帶人類疾病之一，全球至少有240萬(wàn)人感染片形吸蟲(chóng)病，1.8億人處于感染風(fēng)險(xiǎn)中。可見(jiàn)，片形吸蟲(chóng)病是影響世界公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)發(fā)展的重要問(wèn)題。
　　在前期的片形吸蟲(chóng)蛋白組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，14-3-3家族相關(guān)蛋白(14-3-3e)和Ra

2、s家族相關(guān)蛋白(Rab-10)是大片吸蟲(chóng)的排泄分泌蛋白(FgESPs)，且能夠在體內(nèi)與山羊的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)結(jié)合。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，14-3-3家族相關(guān)蛋白涉及寄生蟲(chóng)的多種生物學(xué)過(guò)程，包括初級(jí)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄和應(yīng)激反應(yīng);Ras家族相關(guān)蛋白是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組成蛋白，在寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。然而，有關(guān)大片吸蟲(chóng)14-3-3e和Rab-10對(duì)山羊PBMCs功能的影響到目前為止還不清楚

3、。因此，本論文對(duì)大片吸蟲(chóng)14-3-3e基因和Rab-10基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)和序列分析，探索了14-3-3e和Rab-10重組蛋白在體外對(duì)山羊PBMCs功能的影響。
　　通過(guò)對(duì)大片吸蟲(chóng)14-3-3e基因和Rab-10基因的克隆、表達(dá)和序列分析，結(jié)果表明它們的大小分別為774bp和618bp，分別編碼257個(gè)和205個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量分別約為30kDa和23kDa;它們的序列分別與GenBank中肝片吸蟲(chóng)14-3-3蛋白基因和

4、Ras家族相關(guān)蛋白基因的同源性分別為100％和99％;r14-3-3e重組蛋白為可溶性表達(dá)，而rRab-10重組蛋白為包涵體表達(dá)，且都具有較好的純化效果;分別用人工感染大片吸蟲(chóng)的山羊血清進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果表明這兩種重組蛋白都具有良好的免疫原性。
　　當(dāng)兩種不同濃度的重組蛋白分別與山羊PBMCs共孵育后，通過(guò)采用間接免疫熒光技術(shù)(IFA)分別觀察它們與山羊PBMCs的結(jié)合情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩種重組蛋白都能與山羊

5、的PBMCs結(jié)合;通過(guò)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)山羊PBMCs IL-4、IL-10、TGF-β和IFN-γ的分泌情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明r14-3-3e顯著抑制了山羊PBMCs IL-4和IFN-γ的分泌，顯著促進(jìn)了IL-10和TGF-β的分泌，而rRab-10顯著促進(jìn)了山羊PBMCs IL-4、IL-10、TGF-β和IFN-γ的分泌;通過(guò)采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒檢測(cè)山羊PBMCs的增殖情

6、況，發(fā)現(xiàn)這兩種重組蛋白都能顯著抑制山羊PBMCs的增殖，通過(guò)采用遷移小室研究山羊PBMCs的遷移情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明r14-3-3e顯著抑制了山羊PBMCs的遷移，而rRab-10顯著促進(jìn)了山羊PBMCs的遷移;用總一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)山羊PBMCs的NO產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)這兩種重組蛋白都能顯著促進(jìn)山羊PBMCs NO的產(chǎn)生，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)山羊單核細(xì)胞的吞噬能力，發(fā)現(xiàn)r14-3-3e顯著抑制了山羊單核細(xì)胞的吞噬能力，而rRab-