抗大片吸蟲分泌排泄抗原單克隆抗體的制備及生物學活性的鑒定.pdf

1、大片吸蟲（Fasciolagigantica）是一種危害反芻動物健康的常見寄生蟲，嚴重影響動物的正常生長發(fā)育，給農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)都帶來了巨大的經(jīng)濟損失。因此，建立一種快速診斷大片吸蟲的免疫學方法具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 本研究利用雜交瘤技術(shù)，以大片吸蟲分泌排泄抗原作為免疫原，用建立的間接ELISA法進行篩選，制備了5株抗大片吸蟲分泌排泄抗原單克隆抗體雜交瘤細胞株，分別命名為6D3、6B4、7D1、7D2、7D4。經(jīng)鑒定5株雜交瘤細

2、胞染色體計數(shù)為90～110條，均大于親本細胞，其亞類鑒定分別屬于IgG2b，IgM，IgG1，IgM和IgM，5株單抗的輕鏈均為k型；經(jīng)測定5株單抗上清效價分別為1：400、1：3200、1:6400、1：25600、1：6400，腹水效價分別為1:104、1:104、1:107、1:105、1：106;表位測定表明這五株McAb中，6D3與7D1、7D2，7D4與7D1、7D2作用于不同的表位，6D3與6B4可能識別同一表位或重疊表位

3、，或同一表位有空間位阻，7D4與6D3，6B4與7D4、7D1、7D2可能具有空間位阻；5株單抗的相對親和力為6B4>7D4>7D1>6D3>7D2;對傳代細胞株和凍存復(fù)蘇細胞株的測定表明，5株雜交瘤細胞株均能穩(wěn)定地分泌單克隆抗體。
　　 用單克隆抗體7D1包被ELISA板，用大片吸蟲分泌排泄抗原免疫家兔，按常規(guī)方法制備兔多克隆抗體作為第二抗體，建立了檢測大片吸蟲分泌排泄抗原的雙抗體夾心ELISA方法，結(jié)果表明，該雙抗體夾心EL

4、ISA的最佳反應(yīng)條件為：單克隆抗體7D1包被濃度為12.282ug/mL，兔抗牛多克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)為1：10000，酶標抗體工作濃度為l：8000，最佳封閉液為10％的脫脂奶粉，血清作用時間為lh，多克隆抗體作用時間為lh，酶標二抗作用時間為45min，底物顯色時間為20min，酶標抗體以0D450nm≥0.130作為陰陽臨界值。用該ELISA方法分別檢測胰闊盤吸蟲ES抗原、前后盤吸蟲ES抗原、伊氏錐蟲VSG抗原、弓形蟲IHA抗原、

5、旋毛蟲和泰勒蟲抗原。結(jié)果表明，該ELISA方法與以上病原均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。敏感性實驗結(jié)果表明，該方法的最低檢測下限為55.93ng/mL。同時檢測247份臨床樣品，抗原檢出率為23.89％。
　　 本研究成功制備了五株穩(wěn)定分泌抗大片吸蟲分泌排泄抗原的單克隆抗體雜交瘤細胞系，建立了間接ELISA方法和雙抗體夾心ELISA方法，并對臨床血清樣品的大片吸蟲循環(huán)抗原進行了檢測，這些研究成果為大片吸蟲病的免疫診斷、防治等的進