花生2s-4b基因克隆、原核表達(dá)及表達(dá)蛋白體外抑制肺腺癌細(xì)胞的研究.pdf

1、已有研究表明，花生蛋白具有一定的藥用價值，但對其中的2s蛋白的藥用價值研究較少。本論文著重研究花生2s-4b基因的克隆、原核表達(dá)及其融合蛋白抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，為以后進(jìn)一步深入研究其抑癌機(jī)制提供實驗和理論依據(jù)。
　　 以發(fā)育中后期的花生（Arachis hypogaea L.）種子為材料，根據(jù)本實驗室得到的花生2s蛋白雙向電泳及2s-4b的MS質(zhì)譜分析結(jié)果，設(shè)計簡并引物，利用RT-PCR方法進(jìn)行梯度P

2、CR擴(kuò)增；根據(jù)得到的測序結(jié)果，采用RACE的方法克隆出2s-4b基因。運(yùn)用生物信息學(xué)手段對2s-4b編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、性質(zhì)與功能進(jìn)行分析和預(yù)測，得知其開放閱讀框（ORF）共含519 bp，包括起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，編碼172個氨基酸，分子量為20.1 kDa，等電點(diǎn)為5.96。2s-4b編碼蛋白的N端含有一個長約20個氨基酸的信號肽，具有AAI結(jié)構(gòu)域；其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋組成。
　　 根據(jù)2s-4b基因的OR

3、F序列和原核表達(dá)載體pET-32a的酶切位點(diǎn)設(shè)計了兩條分別含有Nco Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、純化后，利用T4連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta-gami B中。轉(zhuǎn)化子經(jīng)抗性篩選、PCR鑒定、雙酶切鑒定和測序，證明2s-4b基因原核表達(dá)載體pET-32a-2s-4b構(gòu)建成功。從誘導(dǎo)溫度和IPTG終濃度這兩方面優(yōu)化重組蛋白的表達(dá)體系，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果

4、顯示該重組蛋白以包涵體的形式存在。在28℃下用終濃度為0.5 mM的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，得到大小約40 kDa的融合蛋白，其表達(dá)量占菌體體積的58％。
　　 原核表達(dá)產(chǎn)物的純化采用溶菌酶和8 M尿素相結(jié)合，達(dá)到破碎細(xì)菌、包涵體變性溶解的目的，利用His·tag親和純化得到的目的蛋白純度達(dá)75％以上。通過尿素梯度濃度透析復(fù)性，得到具有620 U/mg胰蛋白酶抑制活性的融合蛋白，明膠SDS-PAGE染色結(jié)果表明經(jīng)胰蛋白酶消化5 h

5、后，2 s-4b有一條抑制帶出現(xiàn)，確定2s-4b融合蛋白具有胰蛋白酶抑制活性。
　　 通過MTT法檢測不同濃度2s-4b融合蛋白體外抑制A549細(xì)胞的生長，結(jié)果顯示2s-4b融合蛋白對A549細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，在200μg/ml 2s-4b融合蛋白作用24 h后，A549細(xì)胞生長抑制率可以達(dá)到64％以上，IC50為175μg/ml。利用倒置顯微鏡和HE染色觀察，我們發(fā)現(xiàn)2s-4b融合蛋白能抑制肺腺癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)