花生DGAT2基因的原核表達與亞細胞定位研究.pdf

1、花生是主要油料作物之一,同時也是重要的經(jīng)濟作物.我國是世界上主要的花生生產(chǎn)國家,產(chǎn)量占到世界總產(chǎn)量的40％.花生油作為一種比較容易消化的食用油,在我國食用油中占到30％.植物中三酰基甘油(TAG)是最主要的脂類儲存形式.二酰甘油?；D移酶(DGAT)是TAG合成途徑中的關鍵酶,催化脂?；D移到二酰基甘油(DAG)sn-3位上,并在此過程中起到限速作用.研究表明,DGAT的活性與油脂的積累速率以及含油量是呈正相關.本實驗室從‘魯花14’中

2、已經(jīng)克隆得到兩種類型的DGAT2,分別命名為AhDGAT2a和AhDGAT2b,并從基因水平上進行了相關的研究。本文著重從AhDGAT2蛋白的原核表達以及亞細胞定位兩方面進行研究。由于從植物體內提取純化蛋白比較困難,而且產(chǎn)量低,利用大腸桿菌表達目的基因獲得大量可溶性蛋白是一個方便快捷的方法.通過原核表達獲得AhDGAT2蛋白為抗體制備以及AhDGAT2功能研究提供了理論和實驗依據(jù).
　　pET28a-AhDGAT2原核表達載體構建

3、及表達:根據(jù) AhDGAT2基因的ORF和pET28a原核表達載體的酶切位點選用NcoI和XhoI作為插入位點,將去掉終止密碼子的1002 bp的AhDGAT2的ORF插入到 pET28a原核表達載體,使AhDGAT2的C-端加上6×His Tag.pET28a-AhDGAT2重組載體轉化BL21(DE3)菌株,結果顯示沒有可溶性蛋白表達.嘗試其他菌株 BL21(DE3)pLysS和Transetta(DE3),也未有可溶性蛋白表達.可

4、能 pET28a原核表達載體不適合AhDGAT2的表達.
　　pET28a-AhDGAT2(que)原核表達載體構建及表達:跨膜結構域分析發(fā)現(xiàn)AhDGAT2存在兩個跨膜區(qū). AhDGAT2(que)選用NcoI和XhoI作為酶切位點插入pET28a構建pET28a-AhDGAT2(que)原核表達載體,轉化BL21(DE3)感受態(tài)誘導表達.實驗結果顯示AhDGAT2(que)融合蛋白成功表達.AhDGAT2a(que)融合蛋白分子

5、量約為33.78 kDa,AhDGAT2b(que)融合蛋白分子量約為33.82 kDa.從誘山東師范大學碩士論文導溫度和IPTG濃度兩方面優(yōu)化融合蛋白表達的條件,SDS-PAGE結果顯示,融合蛋白多以包涵體的形式存在.用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒從包涵體中純化到融合蛋白.
　　pGEX-4T-1-AhDGAT2原核表達載體的構建及表達:pGEX-4T-1原核表達載體帶有一個26.97 kDa的GST標簽蛋白.

6、GST-AhDGAT2a融合蛋白分子量約為64.47 kDa,GST-AhDGAT2b融合蛋白分子量約為64.51 kDa.本實驗中,以BamHI和XhoI為酶切位點將AhDGAT2的ORF插入pGEX-4T-1原核表達載體,分別轉化BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Transetta(DE3)菌株誘導表達.SDS-PAGE結果顯示,融合蛋白在3種菌株中均表達.GST標簽必需有活性才能與谷胱甘肽樹脂結合.因此,在融合蛋白

7、純化前對蛋白表達條件進行優(yōu)化是必需的.經(jīng)不同溫度和IPTG濃度誘導后發(fā)現(xiàn)僅30℃時,在上清液和沉淀中均存在融合蛋白.蛋白純化結果顯示,融合蛋白主要以包涵體形式存在.
　　為了確定表達的AhDGAT2(que)和AhDGAT2蛋白在大腸桿菌中是否會起作用,我們對重組菌進行了脂肪酸含量的測定.結果顯示,在BL21(DE3)中,重組菌的總脂肪酸含量均有所增加,但在Transetta(DE3)重組菌中,脂肪酸總含量卻是降低的.而且在這兩種

8、重組菌中,飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸均沒有各自的變化規(guī)律.
　　AhDGAT2的亞細胞定位:我們構建了3種亞細胞定位載體pBSK-35S-AhDGAT2-EGFP,pBSK-35S-EGFP-AhDGAT2(que),pBSK-35S-AhDGAT2-RFP.通過基因槍轉化法使AhDGAT2a和AhDGAT2b在洋蔥表皮細胞中瞬時表達,用激光共聚焦顯微鏡進行觀察.結果顯示,以EGFP作為報告基因時,這兩種蛋白在細胞質、細胞膜與細胞核