新型防御素基因的克隆與原核表達(dá)研究.pdf

1、近年來(lái)由于抗生素的不規(guī)范使用等多種原因，細(xì)菌耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，人 們正努力從各個(gè)方面來(lái)解決，其中機(jī)體天然產(chǎn)生的抗菌肽(antibacterial peptide) 由于其對(duì)耐藥菌的強(qiáng)大抗菌作用而受到人們的關(guān)注。抗菌肽是一種陽(yáng)離子小分 子多肽，在天然免疫和獲得性免疫中都發(fā)揮著重要作用。防御素(defensin)是 抗菌肽中較為重要的一種，主要來(lái)源于皮膚、呼吸道等的上皮組織，是正常機(jī) 體抵抗外界病原微生物入侵的重要防線(xiàn)。

2、 為了構(gòu)建具有廣譜高效的抗菌肽基因，獲得新型抗菌融合蛋白，本實(shí)驗(yàn)采 用了改進(jìn)的重疊區(qū)基因拼接法對(duì)牛的β防御素3(BNBD3)cDNA和人的α防 御素3(HNP3)cDNA分別加以改造。在去除BNBD3的終止密碼子和HNP3 的起始密碼子的基礎(chǔ)上，在BNBD3的5’端引入BamHI酶切位點(diǎn)，并在HNP3 的3’端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，同時(shí)在二者之間加上Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser柔 性連接肽序列。利用多次PC

3、R擴(kuò)增出目標(biāo)片段，并構(gòu)建了 pGEX-4T-1-BNBD3／HNP3原核表達(dá)載體，經(jīng)質(zhì)粒PCR以及BamHI／EcoRI雙酶 切鑒定，測(cè)序結(jié)果證實(shí)：BNBD3／HNP3融合基因已成功克隆至原核表達(dá)載體 pGEX-4T-1。 將已構(gòu)建的BNBD3／HNP3融合蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，用2×YT培養(yǎng)基培養(yǎng)，以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分 析表達(dá)蛋白分子量符合預(yù)期的34.9KDa。融

4、合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞破碎的上 清中以可溶形式存在，將帶有GST標(biāo)簽的融合蛋白用親和層析法純化。融合蛋 白在體外抗菌實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了明顯的抑制大腸桿菌，綠膿桿菌，金黃色葡萄球 菌和肺炎球菌生長(zhǎng)的抗菌活性(P<0.05)，表明我們所構(gòu)建的。BNBD3／HNP3融合抗菌肽是一種新型的具有抗菌活性的蛋白，為開(kāi)發(fā)抗感染制劑或抗生素替代品奠定了基礎(chǔ)。 將已構(gòu)建的BNBD3/HNP3 融合蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)