桃蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆與原核表達.pdf

1、我國是世界上桃[Prunuspersica(L.)Batsch.]的原產(chǎn)地，桃在人民生活和園藝產(chǎn)業(yè)占有非常重要的地位。近年來，隨著生產(chǎn)的發(fā)展和人民生活水平的提高，品種更豐富、品質(zhì)更優(yōu)越的桃的生產(chǎn)成為我國北方落葉果樹中非常重要的課題之一。所有果實品質(zhì)和產(chǎn)量很大程度上決定于果實內(nèi)所含碳水化合物的種類和數(shù)量，桃果實的產(chǎn)量和品質(zhì)也高度依賴于糖類的裝載和卸載水平。蔗糖是同化物從源到庫的長距離運輸?shù)闹饕问?，而蔗糖的裝載、卸載和分配則主要依賴于膜上

2、的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白，但目前關(guān)于桃等核果類植物中是否存在有功能的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白介導糖類的跨膜運輸并不清楚。尤其是庫器官中碳水化合物從韌皮部卸出以及此后的代謝途徑和分子機理還不甚明了。本文報道了一個蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白新基因，并對該基因的結(jié)構(gòu)特點、表達特征進行分析，進而構(gòu)建了原核表達載體，誘導融合表達，為深入研究該基因功能奠定了基礎。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)各組織總RNA的提取。桃葉片總RNA的提取采用改良Trizol法;果實總RNA的提取采

3、用CTAB法;枝條韌皮部、花瓣、萼片等組織總RNA的提取采用SDS-苯酚法;得到了完整性好，無降解，純度高，28S和18S條帶分離清楚的總RNA，能滿足實驗要求。
　　(2)桃蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆和序列分析?？寺〉奶艺崽寝D(zhuǎn)運蛋白基因包含一個完整的開放閱讀框(ORF)，長度1500bp，編碼499個氨基酸，具有12個跨膜區(qū)，41個氨基酸的中央胞質(zhì)環(huán)，分子量約為53.48kD，等電點為9.23，屬于堿性蛋白，并且不含信號肽。推導氨基

4、酸序列分析顯示，該基因含有保守的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白功能域，屬于MFS(Majorfacilitatorsuperfamily)蛋白家族和GPH超家族（GPHfamilysucrose/H+symporter）中的一員。其氨基酸序列與梨、蘋果的同源性最高，都為87％。核苷酸序列分析顯示，與蘋果的相似性最高，為90％，草莓、大豆、獼猴桃、黃瓜的相似性分別為85％、76％、76％、75％。進行系統(tǒng)進化樹聚類分析，結(jié)果表明:蘋果和梨聚類在同一分支上，

5、但它們編碼的氨基酸序列進化距離不同步，后與桃PpSUT1聚為一類，親緣關(guān)系最近;因此推測桃PpSUT1的功能與蘋果MdSUT1的功能相似。與牡丹的進化距離較遠，說明MFS家族基因編碼的氨基酸序列在進化過程中可能存在種屬差異性。
　　(3)桃蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的時空表達。應用Real-TimePCR技術(shù)來研究桃蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達特征。在桃的葉片、韌皮部、果實、花瓣、雌蕊、雄蕊、萼片組織中均檢測到PpSUT1有表達，并在不同

6、組織不同時期表達量存在明顯的差異。桃果實發(fā)育過程中蔗糖含量的變化與蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達量呈正相關(guān)。
　　(4)桃pMAL-c2x-PpSUT1原核表達載體的構(gòu)建與鑒定。將蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的中央胞質(zhì)環(huán)片段亞克隆到原核表達載體pMAL-c2x中，經(jīng)菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定、測序鑒定，確定桃SUT基因插入的位置、大小、方向均正確，證實成功構(gòu)建了原核表達載體。
　　(5)桃pMAL-c2x-PpSUT1在大腸桿菌中的表達。將獲得的重組質(zhì)