凡納濱對(duì)蝦桃拉綜合征病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、凡納濱對(duì)蝦是全球最重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦品種之一，在世界范圍內(nèi)大量養(yǎng)殖。但其病害也日益嚴(yán)重，對(duì)蝦病毒病暴發(fā)流行給世界對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)海洋資源的可持續(xù)發(fā)展造成巨大威脅，因此對(duì)蝦病毒病的研究已成為當(dāng)前世界蝦病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。桃拉綜合征是最主要的一種影響凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)量的病毒病，其致死率高達(dá)90％以上。桃拉綜合征最初僅在南美洲的厄瓜多爾發(fā)現(xiàn)，但通過(guò)運(yùn)輸感染了病毒的仔蝦和親蝦將病毒擴(kuò)散到美洲，并進(jìn)一步擴(kuò)散到全世界。目前，桃拉病毒的診斷

2、方法有組織病理學(xué)方法、cDNA探針的原位雜交法、RT—PCR法，但是這些方法均不符合口岸部門快速檢疫的要求，因此急需一種快速準(zhǔn)確的檢疫方法。 本研究根據(jù)GenBank中桃拉病毒的全基因組序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增該病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白基因vp1、vp2、vp3的相應(yīng)引物，以發(fā)病的凡納濱對(duì)蝦中提取的總RNA為模板，利用RT—PCR技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行了擴(kuò)增，分別獲得分子量為1164bp、849bp和507bp的基因片段，片段大小與預(yù)期一致。將目

3、的片段與pTA2載體連接，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，獲得陽(yáng)性重組子pTA—vp1、pTA—vp2、pTA—vp3。目的片段測(cè)序結(jié)果的Blast分析表明已成功獲得相關(guān)蛋白的基因片段。將此陽(yáng)性重組子和pET-28a載體分別進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET—VP1、pET—VP2和pET—VP3，重組子經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS—PAGE檢測(cè)。SDS—PAGE電泳的結(jié)果表明，在37℃下，0.5