AIF-1基因的原核表達(dá)及細(xì)胞分布的初步研究.pdf

1、同種異體移植炎癥因子(allograft inflammatory factor-1，AIF-1)，又稱離子化Ca2+結(jié)合調(diào)節(jié)器(ionized calcium-binding adapter molecule1，Iba1)，最初克隆自大鼠發(fā)生慢性排斥反應(yīng)的同種異體心臟移植物中。到目前為止，許多物種的AIF-1基因已被克隆，包括人、小鼠、鯉魚、海綿、盤鮑等。AIF-1在大鼠精細(xì)胞中高表達(dá)，在多種組織及血清中有低蛋白水平存在。AIF-1能

2、夠結(jié)合并交聯(lián)肌動蛋白，在巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞骨架的重組中具有重要的作用。在動脈損傷和炎癥下的血管平滑肌細(xì)胞中，AIF-1可被誘導(dǎo)產(chǎn)生，并能促進(jìn)其增殖和遷移。此外，子宮內(nèi)膜異位病人的腹水及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液中，AIF-1的表達(dá)上調(diào)。AIF-1的表達(dá)分布機(jī)制及與病理過程的相關(guān)性，需要進(jìn)一步深入研究。
　　首先我們從毛冠鹿(Elaphodus cephalophus, tufted deer)睪丸cDNA文庫中克隆到AIF

3、-1基因。該cDNA具有5’和3’非編碼區(qū)，從第81個到第518個核苷酸為一開放閱讀框，編碼一個145 aa的AIF-1蛋白。根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物，將基因克隆至大腸桿菌表達(dá)載體pET-28a(+)中誘導(dǎo)表達(dá)，并對重組蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4h后，在約20kDa處有一明顯條帶與理論值大小相近，Western Blot檢測其可被抗AIF-1抗體識別，說明表達(dá)成功。超聲破碎后離心，重組蛋白主要存在

4、于上清液中，可用于制備抗體以進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　其次我們檢測了不同細(xì)胞系中AIF-1 mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)狀況。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，AIF-1在HL-60細(xì)胞系中高表達(dá)，在Jurkat細(xì)胞系中表達(dá)水平較低。設(shè)計引物，從HL-60細(xì)胞系中克隆人AIF-1 cDNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-C3-AIF-1，pEGFP-N1-AIF-1，通過EGFP示蹤AIF-1蛋白的細(xì)胞分布。轉(zhuǎn)染Hela、29