家蠶BmAWD基因的表達(dá)、純化和亞細(xì)胞定位.pdf

1、在對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶蛹期cDNA文庫(kù)測(cè)序中，我們篩選到一條編碼AWD(abnorma.win.disc)蛋白的cDNA序列，將其命名為BmAWD基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因序列全長(zhǎng)為68.bp，ORF框?yàn)?6.bp，編碼154個(gè)氨基酸殘基，含有一個(gè)NDPK保守結(jié)構(gòu)域。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得該基因ORF框并克隆到表達(dá)載體pGEX-5X-1上，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-5X-1-AWD，將該重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)PCR、酶切鑒

2、定證明重組正確。在37℃下以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體并裂解，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在4.kD左右處有一特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符，但目的蛋白主要以沉淀即包涵體形式存在，25℃下誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明目的蛋白主要存在于上清中。采用親和層析法純化融合蛋白GST-AWD，并免疫新西蘭大白兔，制備GST-AWD多克隆抗體，ELISA檢測(cè)該多克隆抗體的效價(jià)可達(dá)到1:16000，Wester.blot檢測(cè)顯示該抗體對(duì)GST-AWD

3、有特異性識(shí)別能力。亞細(xì)胞定位表明蛋白BmAWD同時(shí)存在于Bm5細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中。提取五齡蠶的各個(gè)組織和各個(gè)時(shí)期(卵，幼蟲(chóng)，蛹，蛾)的總RNA，進(jìn)一步用熒光相對(duì)定量PCR檢測(cè)表明BmAWD在表皮中表達(dá)量最高，脂肪體中表達(dá)量最低，在蛹期中表達(dá)量最高，在卵期表達(dá)量最低。
　　 AWD基因?yàn)槔ハx(chóng)翅盤異常發(fā)育基因，它編碼一個(gè)具有NDP激酶活性的蛋白亞基，NDP激酶除了催化核苷二磷酸(NDP)和核苷三磷酸(NTP)之間高能磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)