家蠶中一個新的膜蛋白基因HW的融合表達和純化.pdf

1、本研究從實驗室的膜蛋白庫中篩選出一個膜蛋白,通過分析預(yù)測這個蛋白有三個跨膜區(qū),為一個未知功能的膜蛋白,將其命名為HW。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),HW基因cDNA全長1230bp,開放閱讀框(ORF)大小為294 bp,編碼97個氨基酸殘基,預(yù)測分子量大小約為10.93kD?；谀さ鞍纂y表達的問題,本課題利用多角體融合表達分別在大腸桿菌和家蠶細胞中表達該膜蛋白基因。根據(jù)HW基因cDNA序列的ORF框設(shè)計一對特異引物,PCR擴增出目的基因,克隆到

2、本實驗室構(gòu)建的融合多角體基因的載體pBacPAK8-Ph獲得重組載體pBacPAK8-Ph-HW,該載體可以將HW基因與多角體基因融合,兩者之間插入TEV酶基因序列,便于HW膜蛋白與多角體蛋白的分離。雙酶切pBaePAK8-Ph-HW載體獲得Ph-HW片段,克隆到pET-28a(+)相同酶切位點獲得重組原核表達載體pET-28aq(+)-Ph-HW,將構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)化BL21(DE3)E.coli感受態(tài)細胞,經(jīng)PCR、BamHⅠ/

3、NotⅠ酶切鑒定以及測序分析證實重組正確。采用終濃度為1mM的IPTG、28℃條件下誘導(dǎo)重組蛋白表達,裂解菌體SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)有大小約40kD的目的條帶。利用親和層析方法純化融合蛋白后,TEV酶酶切得到膜蛋白HW。家蠶細胞表達該目的蛋白,根據(jù)Bac-to-Bac系統(tǒng),將上述獲得的HW與多角體融合基因Ph-HW片段插入到pFastBacTMHTB載體構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac-Ph-HW,將pFastBac-Ph-HW重組載

4、體轉(zhuǎn)化E.coli DH10BacTM感受態(tài)細胞。重組pFastBae-Ph-HW載體與穿梭載體bacmid發(fā)生同源重組,獲得重組bacmid桿粒。重組成功的bacmid轉(zhuǎn)染家蠶細胞,收集重組桿狀病毒繼續(xù)感染家蠶細胞,三次感染細胞后的重組桿狀病毒用來大量感染家蠶正常細胞,收集感染的細胞進行SDS-PAGE和Western blot分析,結(jié)果表明多角體融合的家蠶HW基因在家蠶細胞中成功表達。家蠶細胞中HW基因的RNAi實驗表明該基因?qū)倚Q