家蠶膜鎂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(BmMMgT)的表達(dá)、純化和功能的初探.pdf

1、在生命活動(dòng)中膜蛋白承擔(dān)著不可替代的生物學(xué)功能，成為許多分子藥物作用時(shí)的主要靶點(diǎn)，但由于其自身具有的一些特性，天然膜蛋白的分離和純化成為目前最大的難題。目前融合標(biāo)簽技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于研究膜蛋白的晶體結(jié)構(gòu)和生物功能之中。膜蛋白基因家族MMgT于2007年在非洲蟾蜍的卵母細(xì)胞中被首次鑒定，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該家族是轉(zhuǎn)運(yùn)鎂離子的蛋白家族之一。但家蠶中是否存在MMgT膜蛋白尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　 本研究從家蠶蠶蛹cDNA文庫(kù)中，獲得一條與M

2、g2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜蛋白基因，命名為BmMMgT，生物信息學(xué)分析表明該蛋白是一個(gè)單次跨膜蛋白。為了研究BmMMgT在家蠶中的功能，首先利用DNA重組技術(shù)將BmMMgT基因克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后融合蛋白得到了高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳離子親和層析柱和陰離子交換柱純化得到純度較高的融合蛋白，質(zhì)譜鑒定的結(jié)果表明該蛋白為目的蛋白。接著用純化的融合蛋白為抗原，免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，經(jīng)間接ELISA法測(cè)定其效價(jià)達(dá)

3、1∶25600以上。同時(shí)利用載體上的凝血酶酶切位點(diǎn)，純化出了無(wú)標(biāo)簽的膜蛋白BmMMgT。為了解析膜蛋白BmMMgT的三維結(jié)構(gòu)，本研究不僅對(duì)該膜蛋白的結(jié)晶條件進(jìn)行了篩選，同時(shí)也對(duì)該膜蛋白與本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)解結(jié)構(gòu)的Mn-SOD融合表達(dá)的蛋白進(jìn)行了結(jié)晶條件的初篩。進(jìn)一步利用His-tagpulldown技術(shù)研究了膜蛋白BmMMgT與蠶蛹粉全蛋白相互作用的分析，質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明釣出的該蛋白可能是家蠶神經(jīng)肽前體(orcokninprecursor)。