家蠶Hippo通路主基因BmYki的克隆、表達(dá)及功能初探.pdf

1、Hippo通路是近年發(fā)現(xiàn)的一條通過調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及凋亡等過程從而控制器官大小的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路在果蠅及哺乳動(dòng)物中非常保守。轉(zhuǎn)錄共激活因子Yorkie（Yki）是Hippo通路下游的核心成員，Hippo通路主要經(jīng)由Yki調(diào)控下游靶基因進(jìn)并實(shí)現(xiàn)控制器官大小的功能。家蠶是著名的經(jīng)濟(jì)昆蟲和鱗翅目模式昆蟲。研究家蠶器官大小調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路及其關(guān)鍵基因，對(duì)于揭示鱗翅目昆蟲的共有生物性狀以及利用基因靶標(biāo)改造家蠶的生產(chǎn)性能，具有重要理論價(jià)值

2、和現(xiàn)實(shí)意義。
　　本研究以家蠶Hippo通路下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子BmYki為靶標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行克隆以及基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、時(shí)空表達(dá)特征等分析，并重點(diǎn)在細(xì)胞水平上探究其生物學(xué)功能。取得的主要結(jié)果如下：
　　1、BmYki基因的克隆及序列特征分析
　　自家蠶中鑒定并克隆了BmYki基因的CDS序列，其中從二化性大造品系中克隆了3種剪接形式BmYki-S1、BmYki-S2和BmYki-S3，從多化性黃血品系中克隆了4種剪接形

3、式BmYki-S1、BmYki-S2、BmYki-S3和BmYki-S4。這是迄今為止首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄共激活因子Yki存在多種選擇性剪接形式。
　　2、BmYki基因的亞細(xì)胞定位分析
　　選取BmYki-S1和BmYki-S2兩種剪接形式，構(gòu)建了BmYki-S1和BmYki-S2分別與 EGFP融合的亞細(xì)胞定位表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞株 BmNs并進(jìn)行DAPI染色和熒光觀察，結(jié)果表明BmYki-S1和BmYki-S2均定位在B

4、mNs的細(xì)胞質(zhì)中，這與果蠅及哺乳動(dòng)物Yki基因的定位結(jié)果類似。
　　3、BmYki基因的組織和發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析
　　利用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)BmYki基因在五齡第3天家蠶各主要組織以及一齡1天至化蛾1天等發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，BmYki基因在檢測(cè)的各組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平較低，其中在后部絲腺和中部絲腺的表達(dá)水平相對(duì)最高，在精巢、卵巢、氣管、頭部的表達(dá)水平相對(duì)較高，在脂肪體、血液、馬氏管、前部絲腺中的

5、表達(dá)水平相對(duì)最低。BmYki基因在五齡3天和化蛾1天各有一個(gè)表達(dá)峰值，其中五齡3天的峰值最高，其他各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平較低。BmYki基因在絲腺以及絲蛋白開始大量合成的五齡第3天表達(dá)最為活躍，暗示其可能參與了絲腺或絲蛋白合成調(diào)控。
　　4、BmYki基因的細(xì)胞超表達(dá)分析
　　利用GAL4/UAS雙元表達(dá)系統(tǒng)，在家蠶胚胎細(xì)胞株BmE中過表達(dá)BmYki基因，然后對(duì)11個(gè)已知的Hippo通路下游靶基因以及11個(gè)絲蛋白合成相關(guān)基因的

6、表達(dá)情況進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：下游靶基因Myc、Ras、E2F1、Diap1、Caspase1、Kibra和Ex均有顯著上調(diào)表達(dá)；Diap2、Caspase9略有上調(diào)表達(dá)；Wg略有下調(diào)表達(dá)；CycE和基因無明顯變化；絲蛋白合成相關(guān)基因FibH、P25、Seri1、Seri2、Seri3、SGF1、SGF2和 SGF3出現(xiàn)明顯下調(diào)表達(dá)； FibL、Sage和Dimm無明顯變化。上述結(jié)果表明，家蠶BmYki（Hippo通路）具有

7、調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程的功能，并參與了絲蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控。
　　5、BmYki基因的細(xì)胞敲除分析
　　利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在家蠶胚胎細(xì)胞株BmE中進(jìn)行了BmYki基因敲除，然后對(duì)11個(gè)已知的Hippo通路下游靶基因以及11個(gè)絲蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：敲除BmYki基因后，下游靶基因Myc、Ras、Diap1、Caspase9、Caspase1、Kibra和Wg