家蠶Smox基因的克隆及在TGF-β-Smads信號通路中的功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β; TGF-β)是一類多功能的細(xì)胞因子，對細(xì)胞的增殖、分化、胞外基質(zhì)的形成、胚胎發(fā)育、骨的形成和重建具有重要的作用。由于TGF-β作用的多功能性和廣泛性，從1981年Robert發(fā)現(xiàn)TGF-β以來，對它的研究就沿著不同的方向展開，但對其信號傳導(dǎo)的通路一直不清楚。直到近年來發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad家族，才開始深入地研究TGF-β信號從膜到核轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)理。<

2、br>　　 為了研究家蠶生理功能與TGF-β-Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，本論文對家蠶TGF-β-Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一些重要功能基因進(jìn)行了解析。BmSmox基因是家蠶TGF-β-Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個關(guān)鍵功能基因，相當(dāng)于哺乳動物Smad2/3的直系同源物。利用EST分析、PCR技術(shù)等從家蠶組織中克隆了BmSmox基因。為了分析BmSmox基因在家蠶TGF-β-Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)功能，采用與TGF-β-Sma

3、ds信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Smad2/3結(jié)合并負(fù)責(zé)運(yùn)輸?shù)膭恿Φ鞍纵p鏈Rob1基因作為TGF-β-Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)器，利用Rob1基因的表達(dá)變化而改變BmSmox運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)的狀況，分析BmSmox基因的表達(dá)影響調(diào)控靶基因表達(dá)的變化規(guī)律。利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建pBac[A3-GFP-Rob1]表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將表達(dá)載體導(dǎo)入家蠶BmN細(xì)胞。用Real-time PCR技術(shù)，檢測在過表達(dá)Rob1蛋白的條件下，家蠶BmN細(xì)胞中T

4、GF-β-Smads信號通路中Smox基因和下游靶基因p21的表達(dá)化。
　　 本研究得到的實驗結(jié)果如下:
　　 1.BmSmox基因克隆及生物信息學(xué)分析。通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫、電子克隆與實驗克隆相結(jié)合，在家蠶中克隆到一個Smad直系同源基因，該基因位于2號染色體上，命名為BmSmox基因。BmSmox基因ORF框由1335bp堿基組成，編碼444個氨基酸，克隆得到片段基本包含了整個功能域區(qū)域。利用生物信息學(xué)方法解析該基因氨

5、基酸序列的結(jié)構(gòu)和功能域信息:該序列編碼的蛋白的等電點為7.9，分子量為49642.7058。其中第25到135位氨基酸序列為MH1區(qū)功能域，該區(qū)域可以直接與DNA結(jié)合;第249位到355位氨基酸序列為MH2區(qū)功能域，是特異的受體磷酸化位點。用克隆到的該序列與哺乳動物同源的Smad蛋白對比分析顯示:由于羧基端MH2區(qū)有一段特異序列，即絲氨酸片段-SSxS基序，推測該基因與哺乳動物R-Smad家族類相近。同源性分析表明:家蠶BmSmox基因

6、與其他生物的Smox蛋白序列同源性都達(dá)到75％以上，說明該蛋白在生物進(jìn)化過程中十分保守，研究家蠶中的BmSmox基因功能對其他生物也具有重要參考的價值。
　　 2.利用融合PCR獲取GFP-Rob1融合蛋白序列。融合蛋白序列由A3-GFP和Rob1基因連接而成，兩序列長度分別是1405bp和235bp，融合序列長度為1681bp(加酶切位點、His標(biāo)簽、保護(hù)堿基等)，在A3-GFP-Rob1融合片段兩端加入SnaBⅠ和NotⅠ酶

7、切位點。酶切鑒定與測序分析表明擴(kuò)增產(chǎn)物為目標(biāo)融合蛋白A3-GFP-Rob1序列，獲得的融合蛋白序列克隆進(jìn)T載體。
　　 3.pBac[A3-GFP-Rob1]表達(dá)載體構(gòu)建。對上述構(gòu)建的T載體重組質(zhì)粒A3-GFP-Rob1用SnaBⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化，將得到的融合片段連接到同樣雙酶切處理過的PiggyA3GFP表達(dá)載體中，構(gòu)建表達(dá)載體pBac[A3-GFP-Rob1]。挑選pBac[A3-GFP-Rob1]陽

8、性克隆PCR鑒定，測序驗證表明載體構(gòu)建成功。
　　 4.表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞。實驗結(jié)果表明:pBac[A3-GFP-Rob1]和pBac[A3-GFP-Rob1]+helper質(zhì)粒中融合蛋白GFP+Rob1表達(dá)量較高，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，說明Rob1基因在BmN細(xì)胞中過表達(dá)。在相同的時間內(nèi)，添加helper質(zhì)粒的實驗組較未添加組熒光更強(qiáng)。可能說明了在helper的幫助下，融合蛋白被隨機(jī)插入的細(xì)胞基因組中，能隨著細(xì)胞的分裂而復(fù)制到

9、不同的細(xì)胞中，因此細(xì)胞同時分裂時，攜帶綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例更高，所以熒光更強(qiáng)。
　　 5.Real-time PCR技術(shù)檢測BmSmox基因和下游靶基因P21的表達(dá)。研究結(jié)果表明:與未轉(zhuǎn)入Rob1基因的對照組相比，過表達(dá)Rob1基因，BmSmox基因表達(dá)量降低，說明Rob1基因?qū)mSmox基因可能具有負(fù)調(diào)控作用。P21表達(dá)量微弱降低，說明了雖然BmSmox基因表達(dá)抑制，但是其抑制下游靶基因的作用不明顯，該結(jié)果與預(yù)期存在一定差