家蠶TGF-β家族成員dpp和daw基因的功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，生物進(jìn)化的過程中十分保守。在人、小鼠、果蠅等研究中表明TGF-β蛋白是一種多功能的細(xì)胞間信號(hào)蛋白，在細(xì)胞增殖、識(shí)別、凋亡、專一性分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成等方面發(fā)揮重要作用，具有多種生物學(xué)效應(yīng)。雖然在果蠅和哺乳動(dòng)物中TGF-β信號(hào)通路研究的比較深入，但是，家蠶作為鱗翅目中一種典型的模式經(jīng)濟(jì)昆蟲，關(guān)于TGF-β信號(hào)通路的研究還未見報(bào)道。本研究在成功克隆家蠶TGF-β信號(hào)通路上兩個(gè)關(guān)

2、鍵基因Bmdpp和Bmdaw的基礎(chǔ)上，分析了Bmdpp和Bmdaw基因的表達(dá)模式及其蛋白在家蠶BmN細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位；研究了不同病原微生物感染家蠶后對(duì)Bmdpp和Bmdaw mRNA表達(dá)水平的影響；在細(xì)胞水平探討了調(diào)節(jié)Bmdpp和Bmdaw表達(dá)水平對(duì)家蠶核型多角體病毒（BmNPV）和質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）增殖的影響；探究了TGF-β信號(hào)通路與Toll、Imd、JAK/STAT和RNAi通路的相關(guān)性；通過Co-IP篩選了BmN細(xì)胞

3、中可能與Bmdpp和Bmdaw互作蛋白，并利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行了鑒定。期望通過探討家蠶TGF-β信號(hào)通路中Bmdpp和Bmdaw基因的功能，明確TGF-β信號(hào)通路在家蠶先天免疫途徑中的作用，其研究結(jié)果可為家蠶抗病性研究提供新的思路。本研究取得的主要結(jié)果如下：
　　1.家蠶TGF-β信號(hào)通路Bmdpp和Bmdaw基因的克隆及序列分析
　　為了研究家蠶 TGF-β信號(hào)通路的功能，我們參考果蠅的dpp（序列號(hào)：NM_0579

4、63.5）和 daw（序列號(hào)：NM_001273038.1）序列，在家蠶數(shù)據(jù)庫(http://www.silkdb.org/silkdb/)中比對(duì)獲得了家蠶Bmdpp和Bmdaw基因序列。根據(jù)現(xiàn)有的EST序列設(shè)計(jì)了基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR克隆，測(cè)序結(jié)果顯示，Bmdpp的ORF為1110 bp，編碼370aa；Bmdaw的ORF為1086 bp，編碼362aa。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，Bmdpp蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)卷曲和α螺旋；

5、Bmdaw蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為無規(guī)卷曲。Bmdpp和Bmdaw均含有TGF-β蛋白結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其具有TGF-β蛋白活性，且與果蠅dpp和daw同源性較高。
　　2.家蠶Bmdpp和Bmdaw基因表達(dá)譜分析
　　為了探討家蠶 Bmdpp和 Bmdaw基因的表達(dá)規(guī)律，通過實(shí)時(shí)定量 PCR（Real-Time PCR）分析了Bmdpp和Bmdaw基因在家蠶五齡第3天不同組織(精巢、卵巢、脂肪體、頭、絲腺、馬氏管、血細(xì)胞、中腸和氣管

6、叢)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Bmdpp和Bmdaw基因在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，其它組織中表達(dá)量均較低。
　　3.家蠶Bmdpp和Bmdaw蛋白多克隆抗體制備和亞細(xì)胞定位分析
　　為了分析Bmdpp和Bmdaw細(xì)胞定位特征，將Bmdpp和Bmdaw基因分別克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET-28a(+)，在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)，并利用重組蛋白免疫小鼠，制備了抗Bmdpp和Bmdaw的多克隆抗體。Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)制備

7、多克隆抗體具特異性。細(xì)胞定位結(jié)果顯示，Bmdpp和Bmdaw主要定位在BmN細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜中。
　　4. Bmdpp和Bmdaw基因?qū)Σ≡⑸锏母腥緫?yīng)答
　　為了探討B(tài)mdpp和Bmdaw基因?qū)?xì)菌和病毒感染的免疫應(yīng)答，分別利用核型多角體病毒（BmNPV）、質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)和滅活的黑胸?cái)⊙挎邨U菌（Bab）感染家蠶BmN細(xì)胞和4齡家蠶（大造）；用脂多糖（LPS）刺激家蠶BmN細(xì)胞，用滅活的大腸桿菌（E.coli

8、）感染4齡家蠶（大造），按不同時(shí)間點(diǎn)分別收集對(duì)照組、誘導(dǎo)組的細(xì)胞和家蠶組織，提取總RNA，real-time PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在家蠶BmN細(xì)胞中，LPS、Bab和BmCPV刺激均可下調(diào)Bmdpp基因的表達(dá)，提升Bmdaw基因的表達(dá)水平；而BmNPV刺激會(huì)上調(diào)Bmdpp基因的表達(dá)水平，下調(diào)Bmdaw基因的表達(dá)。家蠶（大造）幼蟲感染BmNPV48和72 h后，血液中Bmdpp轉(zhuǎn)錄水平分別是對(duì)照組的4.4和45.9倍，Bmdaw的表達(dá)水平

9、是對(duì)照組的0.5和0.02倍；家蠶幼蟲感染BmCPV48后，中腸中的Bmdpp轉(zhuǎn)錄水平迅速提高至對(duì)照組的34倍，72后下降到與對(duì)照組幾乎一致，而Bmdaw基因的表達(dá)水平與對(duì)照組無顯著變化。
　　5.調(diào)節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因表達(dá)對(duì)BmNPV和BmCPV增殖的影響
　　為進(jìn)一步鑒定Bmdpp和Bmdaw基因的功能，根據(jù)基因的序列分別設(shè)計(jì)、合成了3條siRNA，轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞沉默Bmdpp和Bmdaw基因。分別將Bmdpp

10、和Bmdaw基因克隆進(jìn)載體 pIZT/V5-His，轉(zhuǎn)染家蠶 BmN細(xì)胞系，分別篩選過表達(dá)Bmdpp和Bmdaw基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞。然后，探討調(diào)節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因表達(dá)水平對(duì) BmNPV、BmCPV增殖復(fù)制的影響。感染48 h后的real-time的檢測(cè)結(jié)果顯示，在過表達(dá)Bmdpp基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，BmNPV和BmCPV的增殖水平有不同程度地下降；在過表達(dá)Bmdaw基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，BmNPV的增殖水平明顯下降，BmCPV的增殖水平卻

11、沒有明顯變化。而沉默 Bmdpp和 Bmdaw基因，可不同程度地提升BmNPV、BmCPV的增殖水平。由此推測(cè)Bmdpp和Bmdaw基因的表達(dá)可影響病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖復(fù)制。
　　6. TGF-β信號(hào)通路與家蠶其它信號(hào)通路相關(guān)性分析
　　昆蟲體內(nèi)主要存在Toll、Imd、JAK/STAT和RNAi4種病原體信號(hào)識(shí)別條免疫信號(hào)通路，為了探討TGF-β通路對(duì)免疫通路可能的調(diào)節(jié)作用，我們分別選取了這4種通路的關(guān)鍵基因（spz、PGRP

12、-LB、PGRP-LE、stat、SOCS2、SOCS6、ago2、drc2），利用real-time PCR技術(shù)，檢測(cè)在了過表達(dá)Bmdpp和Bmdaw基因?qū)γ庖咄逢P(guān)鍵基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，過表達(dá) Bmdpp基因，BmSOCS2、BmPGRP-LB的表達(dá)水平分別上調(diào)了14和13倍，Bmdcr2基因的表達(dá)水平也有較明顯上調(diào)。當(dāng)過表達(dá) Bmdaw基因時(shí)，BmSOCS2基因的表達(dá)明水平與對(duì)照組相比下降了97，BmSTAT基因的表達(dá)明

13、顯也被抑制。
　　7. Bmdpp和Bmdaw基因相互作用蛋白的篩選與鑒定
　　為了研究Bmdpp和Bmdaw與家蠶BmN細(xì)胞的相互作用蛋白，采用免疫共沉淀技術(shù)從過表達(dá) Bmdpp和 Bmdaw的家蠶 BmN細(xì)胞中篩選互作蛋白，然后對(duì)與Bmdpp和Bmdaw互作的候選蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，共鑒定了10種蛋白。信息分析結(jié)果顯示，這些蛋白涉及到信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖分化、離子通道、卵巢發(fā)育、核苷酸降解、免疫應(yīng)答、細(xì)胞周期與凋亡等各個(gè)方面

14、。
　　綜上所述，本研究克隆了家蠶TGF-β信號(hào)通路中兩個(gè)基因Bmdpp和Bmdaw，分析了Bmdpp和Bmdaw基因的主要序列特征和表達(dá)模式；明確了Bmdpp和Bmdaw基因?qū)倚Q病原微生物誘導(dǎo)的應(yīng)答反應(yīng)；發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Bmdpp和Bmdaw基因的表達(dá)水平可顯著性地影響B(tài)mNPV和BmCPV在細(xì)胞中的增殖；免疫共沉淀結(jié)果鑒定了在家蠶BmN細(xì)胞中可能與Bmdpp和Bmdaw基因相互作用的蛋白，研究結(jié)果不僅加深了我們對(duì)家蠶TGF-β信號(hào)通