非小細胞肺癌TGF-βⅡ型受體基因突變和表達研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學博士學位論文非小細胞肺癌TGFβⅡ型受體基因突變和表達研究姓名：包陽申請學位級別：博士專業(yè)：外科學（胸心外科）指導教師：徐志云20090501第二軍醫(yī)大學博士學位論文抗人TGFBR2細胞外區(qū)域單克隆抗體，二抗為HRP標記的羊抗鼠抗體；細胞免疫熒光染色一抗同前，二抗為FITC標記的羊抗鼠抗體。結果：1、在兩株來源于同一GCC母細胞系的細胞95D和PG中發(fā)現了TGFBR2一種新的純合截斷突變(c492507del)，并且在其相應

2、的肺癌組織中得到證實。另外，在該患者其他組織(肝、腎等)以及其他15例GCC和LCC(大細胞癌)患者肺癌組織中發(fā)現種系雜合型截斷突變(c492507del)，其突變率分別為2／2GCC和7／13LCC，而在100例其他類型NSCLC(包括腺癌、鱗癌和腺鱗癌)及所有正常對照細胞和組織中未發(fā)現上述突變。2、正常人胚肺成纖維細胞HFLI的TGFBR2外顯子RTPCR擴增產物分別為717bp和805bp，而突變GCC細胞擴增產物分別為701bp

3、和805bp；3、Westernblotting顯示HFLl細胞TGFBR2蛋白為全長，而GCC細胞為截斷蛋白。細胞免疫熒光染色顯示突變的TGFBR2蛋白仍能在細胞膜上表達。結論：1、新發(fā)現的TGFBR2截斷突變(c492507del)只存在于GCC細胞和GCC、LCC組織中，基因突變造成TGFBR2的失活可能在GCC和LCC的發(fā)病機制中起重要作用。2、缺失16bp的TGFBR2截斷突變沒有影響到mRNA的轉錄和剪切，但導致翻譯時提前出

4、現終止密碼子，產生TGFBR2截斷蛋白。3、TGFBR2突變產生的截斷蛋白細胞外區(qū)完整，發(fā)生改變的跨膜區(qū)并未使蛋白從細胞表面釋放，蛋白仍能在胞膜上表達。第二部分TGFBl也截斷突變對TGFB信號傳導通路的影響目的：驗證GCC細胞的TGFBR2截斷突變在TGFB信號傳導通路失活中起了重要作用。方法：1、突變細胞對外源性TGFBl刺激的敏感性試驗：(1)生長抑制試驗：用不同濃度(0，O2，l，5ng／m1)的外源性TGFBl刺激突變細胞，用

5、MTS比色法進行細胞計數來評價細胞的生長狀況，確定TGFBl對突變細胞有無生長抑制效應，TGFpl濃度為5ng／ml時細胞增殖降低40％，認為對TGFBl敏感；(2)外源性TGFpl對突變細胞纖連蛋白(FN)的mRNA表達的影響：對攜帶有突變的GCC細胞分別施加TGFpl濃度為0和5ng／nll的無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48llr后，用實時定量PCR和△△Ct法檢測TGFp1處理前后FN的mRNA相對表達量變化，內參照基因為GAPDH。2、野