晚期非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變狀態(tài)的血清多肽質(zhì)譜研究.pdf

1、非小細(xì)胞肺癌（non–small-cell lung cancer, NSCLC）腫瘤組織表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）基因突變狀態(tài)與表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的療效密切相關(guān)。然而在某些情況下，腫瘤組織量不足、腫瘤細(xì)胞成分過

2、少或腫瘤組織獲取困難都會(huì)導(dǎo)致依賴組織的EGFR基因突變檢測(cè)無法進(jìn)行。目前，應(yīng)用血漿或血清進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)的方法并未被當(dāng)前指南所認(rèn)同，或未在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用于指導(dǎo)EGFR-TKI的治療。因此，仍有必要尋找敏感的非侵入性的應(yīng)用腫瘤組織替代物進(jìn)行EGFR基因突變狀態(tài)評(píng)估的新方法。近年來，由基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（ matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fligh

3、t mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）發(fā)展而來的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于篩選疾病診斷、療效預(yù)測(cè)和預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物。目前，尚未有研究者應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)建立血清多肽/蛋白分類模型來評(píng)估NSCLC患者的EGFR基因突變狀態(tài)。
　　第一部分：
　　EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患者臨床特征及其EGFR-TKI療效分析
　　目的：
　　探討EGFR基因敏感突變的晚期NSCLC患

4、者臨床特征，分析晚期NSCLC患者EGFR基因突變狀態(tài)與EGFR-TKI療效的關(guān)系。
　　方法：
　　對(duì)2011年5月至2014年4月就診于解放軍307醫(yī)院肺部腫瘤內(nèi)科的352名EGFR基因突變狀態(tài)明確（擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)[amplification refractory mutation system, ARMS]法檢測(cè)腫瘤組織）的IIIB/IV期非小細(xì)胞肺癌患者臨床資料、影像學(xué)資料及隨訪資料進(jìn)行回顧性分析。
　　結(jié)果

5、：
　　入組患者中，EGFR基因突變和野生型患者在年齡、病理類型、分期方面無顯著差異；但在性別、吸煙史方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EGFR基因突變患者中女性和非吸煙者所占比例較野生型高。
　　入組的352名晚期NSCLC患者中，250名具有可測(cè)量病灶并接受EGFR-TKI治療。該250名患者中，EGFR基因突變和野生型患者的ORR分別為58.1％（93/160）vs.10.0%（9/90），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.001）；該兩組患

6、者的DCR分別為83.8%（134/160）vs.35.6%（32/90），同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.001）。EGFR基因突變患者的中位PFS為10.0（95%CI,9.0-10.9）個(gè)月；EGFR基因野生型患者的中位PFS為2.0（95%CI,1.8-2.1）個(gè)月，EGFR基因突變患者的PFS明顯長于EGFR基因野生型患者（p＜0.001）。EGFR基因突變患者的中位OS為29.0（95%CI,27.4-30.6）個(gè)月，EGFR基

7、因野生型患者的中位OS為28.0（95%CI,25.4-30.5）個(gè)月，兩組之間OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.657）。
　　結(jié)論：
　　非小細(xì)胞肺癌EGFR基因發(fā)生突變的頻率與人種、性別、吸煙史以及病理類型等臨床背景相關(guān)，與高加索人、男性、吸煙患者和非腺癌患者相比，亞裔人群、女性、非吸煙患者和腺癌患者發(fā)生EGFR基因突變的頻率更高。
　　EGFR-TKI的敏感性與EGFR基因激酶域的活性突變密切相關(guān)，EGFR基因突變患者

8、的EGFR-TKI療效較好，EGFR基因野生型患者EGFR-TKI療效較差。
　　第二部分：
　　晚期非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變狀態(tài)血清多肽質(zhì)譜分類模型的建立與驗(yàn)證
　　目的；
　　應(yīng)用MALDI-TOF-MS蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)尋找與EGFR基因突變狀態(tài)相關(guān)的血清多肽/蛋白，并驗(yàn)證能否建立一個(gè)血清多肽/蛋白分類模型對(duì)EGFR基因突變狀態(tài)進(jìn)行分類，來評(píng)估EGFR基因突變狀態(tài)，以做出恰當(dāng)?shù)闹委煕Q定。
　　方法

9、：
　　挑選EGFR基因突變狀態(tài)明確（ARMS法檢測(cè)腫瘤組織）的III-IV期NSCLC患者入組研究。從EGFR基因突變和野生型患者中各隨機(jī)挑選50人（共100人）組成訓(xùn)練組，剩余患者組成驗(yàn)證組。采集入組患者一線治療前血清，應(yīng)用MALDI-TOF-MS聯(lián)合 Clinprotools v2.1分析軟件對(duì)血清進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖譜分析。用訓(xùn)練組患者波譜數(shù)據(jù)尋找EGFR基因突變和野生型NSCLC患者之間的血清多肽/蛋白差異，并依據(jù)這些差異蛋

10、白建立一個(gè)血清蛋白分類模型評(píng)估NSCLC患者EGFR基因突變狀態(tài)，并用驗(yàn)證組患者波譜數(shù)據(jù)對(duì)該血清蛋白分類模型進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，對(duì)該血清蛋白分類模型識(shí)別的EGFR基因突變狀態(tài)與 EGFR-TKI療效之間的關(guān)系進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：
　　共有316名患者滿足入組條件進(jìn)入該研究。經(jīng)ARMS法檢測(cè)腫瘤組織，明確144名患者為EGFR基因突變患者，172名患者為EGFR基因野生型患者。從2011年5月至2013年4月入組的223名患者中

11、，隨機(jī)挑選EGFR基因突變和野生型患者各50人（共100人）組成訓(xùn)練組，該時(shí)間段入組的其余123名患者（52名患者為EGFR基因突變患者，71名為EGFR基因野生型患者）組成驗(yàn)證組-1。2013年5月至2014年4月入組的93名患者（42名患者為EGFR基因突變患者，51名為EGFR基因野生型患者）組成驗(yàn)證組-2。
　　從訓(xùn)練組患者血清波譜組成的數(shù)據(jù)集中共識(shí)別出129個(gè)峰，其中 EGFR基因突變和野生型患者之間有9個(gè)峰具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

12、異（P＜0.05），m/z分別為1365.1、1866.47、3315.75、3883.79、3956.66、4092.4、4585.05、4643.49和5866.96。
　　用 ClinProTools v2.1軟件內(nèi)嵌數(shù)學(xué)模型分別對(duì)訓(xùn)練組波譜數(shù)據(jù)建立分類模型，其中遺傳算法（genetic algorithm, GA）建立的分類模型GA-7區(qū)分EGFR基因突變和野生型患者的效果最好。該模型由5個(gè)多肽組成，m/z分別為4092.

13、4Da、4585.05Da、1365.1Da、4643.49Da和4438.43Da。
　　用包含123名NSCLC患者的獨(dú)立驗(yàn)證組-1對(duì)分類模型GA-7進(jìn)行盲樣驗(yàn)證，其準(zhǔn)確率為80.5%，敏感性為84.6%，特異性為77.5%。ARMS法檢測(cè)腫瘤組織與蛋白分類模型標(biāo)記血清兩種方法評(píng)估NSCLC患者EGFR基因突變狀態(tài)具有很高的一致性（P＜0.001；Kappa value，0.648）。用包含93名NSCLC患者的獨(dú)立驗(yàn)證組-2

14、對(duì)分類模型GA-7進(jìn)行盲樣驗(yàn)證，其準(zhǔn)確率為83.8%，敏感性為88.1%，特異性為80.4%。同樣，ARMS法檢測(cè)腫瘤組織與蛋白分類模型標(biāo)記血清兩種方法評(píng)估 NSCLC患者 EGFR基因突變狀態(tài)具有很高的一致性（P＜0.001；Kappa value，0.715）。
　　驗(yàn)證組-1的123名 NSCLC患者中，81名患者具有可測(cè)量病灶并接受EGFR-TKI治療。血清樣本被標(biāo)記為“突變”和“野生”的患者，ORR分別為59.6%（28

15、/47）vs.8.8%（3/34），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.001）；該兩組患者的DCR分別為87.2%（41/47）vs.35.3%（12/34），同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.001）。血清樣本被標(biāo)記為“突變”的患者，中位PFS為10.0（95%CI,9.0-10.9）個(gè)月；血清樣本被標(biāo)記為“野生”的患者，中位PFS為2.3（95%CI,1.9-2.7）個(gè)月，血清樣本被標(biāo)記為“突變”的患者 PFS明顯長于血清樣本被標(biāo)記為“野生”的患者

16、（p=0.001）。血清樣本被標(biāo)記為“突變”的患者，中位 OS為29.0（95%CI,25.2-32.8）個(gè)月，血清樣本被標(biāo)記為“野生”的患者，中位OS為28.0（95%CI,17.7-38.3）個(gè)月，兩組之間OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.441）。驗(yàn)證組-2的93名NSCLC患者中，64名患者具有可測(cè)量病灶并接受 EGFR-TKI治療。血清樣本被標(biāo)記為“突變”和“野生”的患者，ORR分別為60.0%（24/40）vs.8.3%（2/24）

17、，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.001）；該兩組患者的DCR分別為87.5%（35/40）vs.29.2%（7/24），同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＜0.001）。血清樣本被標(biāo)記為“突變”的患者，中位PFS為11.0（95%CI,9.5-12.6）個(gè)月；血清樣本被標(biāo)記為“野生”的患者，中位PFS為2.0（95%CI,1.8-2.2）個(gè)月，血清樣本被標(biāo)記為“突變”的患者PFS明顯長于血清樣本被標(biāo)記為“野生”的患者（p＜0.001）。血清樣本被標(biāo)記為“

18、突變”的患者，中位OS為28.0（95%CI,25.3-30.7）個(gè)月，血清樣本被標(biāo)記為“野生”的患者，中位OS為24.0（95%CI,19.2-28.8）個(gè)月，兩組之間OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.280）。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用MALDI-TOF-MS聯(lián)合Clinprotools分析軟件對(duì)EGFR基因突變狀態(tài)明確（ARMS法檢測(cè)腫瘤組織）的NSCLC患者血清進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖譜分析，可以找到EGFR基因突變和野生型NSCLC患

19、者之間的血清蛋白差異，依據(jù)這些差異蛋白建立一個(gè)評(píng)估晚期NSCLC患者EGFE基因突變狀態(tài)的血清分類模型是可行的。該血清蛋白分類模型的分類結(jié)果有可能預(yù)測(cè)EGFR-TKI療效。
　　第三部分：
　　晚期非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變狀態(tài)血清標(biāo)志物的鑒定
　　目的：
　　嘗試對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌患者 EGFR基因突變狀態(tài)備選血清標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　以第二部分 MALDI-TOF-MS分析血清多

20、肽得到的波譜為依據(jù)，選取興趣蛋白峰高表達(dá)的10例患者，各取其蛋白洗脫液5ml合并，凍干，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，得到一級(jí)肽指紋圖譜，在一級(jí)肽指紋圖譜中挑選感興趣的肽峰進(jìn)行MALDI-TOF/TOF-MS分析，得到二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，將二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入BioTools軟件工具采集肽碎片質(zhì)荷比信息，并在MASCOT網(wǎng)站進(jìn)行在線搜庫鑒定。
　　結(jié)果：
　　m/z為1365.1、1866.47和3883.79的3個(gè)蛋白峰得到鑒

21、定，分別為Homer protein homolog3、Mesogenin-1和REM2-and Rab-like small GTPase1。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用“銅螯合納米磁珠（MB-IMAC-Cu2+）聯(lián)合MALDI-TOF/TOF-MS”對(duì)血清肽進(jìn)行鑒定是可行的。Homer protein homolog3、Mesogenin-1和REM2-and Rab-like small GTPase1三個(gè)多肽可能與晚期NS