家蠶GATA結(jié)合蛋白家族鑒定及BmGATA6-like基因功能研究.pdf

1、家蠶作為重要的無脊椎動(dòng)物模型，在其變態(tài)發(fā)育過程中組織形態(tài)會(huì)發(fā)生巨大變化，因此是研究細(xì)胞增殖、分化、凋亡及自噬等生理現(xiàn)象理想的材料。GATA結(jié)合蛋白因子是從低等的線蟲到高等的哺乳動(dòng)物發(fā)育過程中都需要的非常重要的調(diào)控因子，參與個(gè)體胚胎發(fā)育、組織器官發(fā)生、個(gè)體衰老等重要的生命活動(dòng)。本研究以家蠶作為研究對(duì)象，利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫獲得家蠶GATA結(jié)合蛋白序列信息，并重點(diǎn)對(duì)BmGATA6-like基因的功能進(jìn)行分析及研究，將有利于闡明家蠶變態(tài)發(fā)育的

2、分子調(diào)控機(jī)理，促進(jìn)對(duì)昆蟲變態(tài)發(fā)育的全面認(rèn)識(shí)，不僅可以為害蟲的生物防治提供線索，甚至還能為人類的退行性疾病提供數(shù)據(jù)參考。主要研究結(jié)果如下：
　　1.家蠶GATA結(jié)合蛋白家族基因的鑒定
　　通過NCBI及家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫，分析獲得5個(gè)家蠶GATA結(jié)合蛋白家族基因，分別為BmGATA-A-like，BmGATA-C-like，BmBCF I，BmGATA6-like和BmGATA-X。同其它物種中的GATA結(jié)合蛋白類似，它們都具

3、有保守的GATA鋅指結(jié)構(gòu)域，其中BmGATA-A-like和BmGATA-X只含有一個(gè)GATA鋅指結(jié)構(gòu)域，BmGATA-C-like，BmBCFI和BmGATA6-like都含有兩個(gè)典型的GATA鋅指結(jié)構(gòu)域。5齡3天家蠶各組織芯片數(shù)據(jù)顯示家蠶GATA結(jié)合蛋白的表達(dá)量較低，且各成員間的表達(dá)情況存在較大差異。保守結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化分析顯示家蠶GATA結(jié)合蛋白家族成員主要與昆蟲的GATA結(jié)合蛋白聚為一類，其中BmGATA-A-like與果蠅的Pan

4、nier聚為一類，BmBCFI與赤擬谷盜的GATAa及果蠅的Serpent聚為一類，BmGATA6-like與鱗翅目昆蟲的GATA結(jié)合蛋白聚為一類，BmGATA-X與意大利蜂的GATA4-like最為保守，而BmGATA-C-like則單獨(dú)聚為一類；保守結(jié)構(gòu)域的物種間多序列比對(duì)顯示GATA鋅指結(jié)構(gòu)域序列同源性非常高。
　　2.家蠶BmGATA6-like基因的克隆與表達(dá)分析
　　通過家蠶基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)序列信息及NCBI b

5、last序列，克隆得到家蠶BmGATA6-like基因全長(zhǎng)cDNA序列（為了簡(jiǎn)潔，后文中將以BmGATA6代替稱呼BmGATA6-like）。該基因全長(zhǎng)為4011bp，含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子；其ORF框長(zhǎng)1974bp，編碼657個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的蛋白分子量為70.8kDa，等電點(diǎn)pI為6.13。BmGATA6蛋白含有兩個(gè)典型的GATA鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，分別位于第464~516位氨基酸基序和524~576位氨基酸基序；在線軟件預(yù)測(cè)其不含

6、信號(hào)肽。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其在家蠶胚胎、5齡3天各組織中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果顯示BmGATA6基因在家蠶胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，在胚胎發(fā)育的后期持續(xù)高表達(dá)，在胚胎發(fā)育第6天及孵化出的蟻蠶中表達(dá)量最高；5齡3天各組織中，BmGATA6在各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)，但是在中腸中的表達(dá)量顯著高于其它組織。檢測(cè)BmGATA6在表達(dá)較高的中腸組織和表達(dá)較低的血液不同時(shí)期的表達(dá)情況，結(jié)果顯示中腸組織中BmGATA6持續(xù)表達(dá)，并且在眠

7、期及變態(tài)發(fā)育前期顯著高表達(dá)；血細(xì)胞中BmGATA6的表達(dá)模式與中腸組織中的表達(dá)模式極其相似，同樣是在眠期及變態(tài)發(fā)育時(shí)期顯著高表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)BmGATA6在中腸組織和血細(xì)胞中的表達(dá)定位情況，結(jié)果顯示BmGATA6在家蠶中腸所有類型的細(xì)胞中均有高量表達(dá)，且只集中表達(dá)于中腸組織細(xì)胞的細(xì)胞核中；L5D3家蠶血細(xì)胞中，檢測(cè)到BmGATA6在顆粒細(xì)胞中有微量的表達(dá)，且只在顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，漿細(xì)胞中不能檢測(cè)到BmGATA6信號(hào)。這些結(jié)果暗示

8、著BmGATA6基因在家蠶生長(zhǎng)及變態(tài)發(fā)育過程中扮演重要角色。
　　3.家蠶BmGATA6-like基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制研究
　　構(gòu)建BmGATA6過表達(dá)載體，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法在家蠶胚胎細(xì)胞系BmE中過表達(dá)BmGATA6基因。Western blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后24h BmGATA6蛋白就開始表達(dá)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其蛋白含量也逐漸增多。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示從轉(zhuǎn)染后48h開始，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)細(xì)胞碎裂的現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染后72

9、h及96h，其周圍細(xì)胞碎片明顯增多。分別用DAPI及Tunel染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，DAPI染色結(jié)果顯示過表達(dá)BmGATA6的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)松散，染色質(zhì)呈不規(guī)則形狀分布；Tunel染色后計(jì)數(shù)結(jié)果顯示Tunel的著色率明顯高于對(duì)照組。熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染過表達(dá)BmGATA6基因后BmE細(xì)胞中家蠶凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量變化，結(jié)果顯示相關(guān)基因表達(dá)量被顯著上調(diào)；凋亡執(zhí)行蛋白Caspase3/7活性檢測(cè)顯示其活性也被明顯上調(diào)。以上實(shí)驗(yàn)說明BmGATA

10、6可以誘導(dǎo)家蠶細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　利用BmGATA6抗體進(jìn)行免疫沉淀，并將得到的產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析鑒定，篩選得到可能與BmGATA6互作的蛋白數(shù)量為11個(gè)，根據(jù)分子量大小及功能等因素最后確定可以促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡的PARP為目的蛋白；免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PARP與BmGATA6蛋白共同在細(xì)胞核中表達(dá)；進(jìn)一步免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BmGATA6可以與PARP蛋白相互作用。這些結(jié)果暗示BmGATA6誘發(fā)的細(xì)胞凋亡可能與PARP蛋白的相

11、互作用相關(guān)。
　　4.FOG蛋白抑制BmGATA6誘發(fā)細(xì)胞凋亡
　　通過比較在家蠶胚胎細(xì)胞系BmE和家蠶卵巢細(xì)胞系BmNs中分別過表達(dá)BmGATA6的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)不表達(dá)家蠶FOG因子BmUsh的BmE細(xì)胞系相較于高量表達(dá)BmUsh的BmNs細(xì)胞系，BmGATA6過表達(dá)誘發(fā)的凋亡現(xiàn)象更為快速且更為明顯。同時(shí)在BmE細(xì)胞系中過表達(dá)BmGATA6和BmUsh，經(jīng)顯微鏡觀察結(jié)果顯示由BmGATA6誘發(fā)的細(xì)胞凋亡明顯得到了抑制；Tune

12、l染色后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示與單獨(dú)過表達(dá)BmGATA6基因相比，共同過表達(dá)BmGATA6和BmUsh基因的Tunel信號(hào)數(shù)量明顯下降，且Caspase3/7的活性也明顯降低。結(jié)果說明家蠶的FOG因子BmUsh可以抑制由過表達(dá)BmGATA6誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。
　　通過原核表達(dá)及蛋白純化，獲得具有活性的BmGATA6重組蛋白，利用Far-western證明BmGATA6可以與BmUsh蛋白相互作用，且其作用區(qū)域在BmGATA6的N端；進(jìn)一步免

13、疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了家蠶FOG因子BmUsh蛋白可以在與BmGATA6共同過表達(dá)的情況下與PARP蛋白結(jié)合，但是單獨(dú)過表達(dá)BmUsh時(shí)不能與PARP結(jié)合。說明BmUsh通過與BmGATA6結(jié)合間接與PARP相互作用。
　　熒光定量PCR檢測(cè)家蠶中腸組織和血細(xì)胞中BmUsh和BmGATA6的時(shí)期表達(dá)變化，進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)中腸組織中BmGATA6表達(dá)量較高，血細(xì)胞中BmUsh表達(dá)量較高，但無論是在中腸組織還是血細(xì)胞中，兩者的表達(dá)模式極為相

14、似，都在眠期及變態(tài)發(fā)育時(shí)期高量表達(dá)。由此結(jié)果推測(cè)家蠶FOG因子BmUsh與BmGATA6在眠期和變態(tài)時(shí)期通過相互作用，共同調(diào)控家蠶的正常生長(zhǎng)及變態(tài)發(fā)育。
　　5.家蠶BmGATA6基因的功能
　　綜合上述結(jié)論與分析，我們推測(cè)家蠶BmGATA6在家蠶生長(zhǎng)及變態(tài)發(fā)育過程中，被某些生長(zhǎng)因子或者激素等誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在組織細(xì)胞發(fā)生程序性死亡過程中，通過與PARP蛋白的相互作用或者其它目前還未知的調(diào)控機(jī)制共同誘導(dǎo)家蠶組織細(xì)胞發(fā)生凋亡，當(dāng)