牛SRY基因表達及其蛋白結(jié)合功能鑒定.pdf

1、奶牛是經(jīng)濟價值較高的動物，實現(xiàn)對奶牛的性別控制必將大幅度的促進經(jīng)濟的增長，因此控制奶牛的性別顯得越來越重要?？刂婆５男詣e主要決定于對性別形成機制的了解，Y染色體性別決定基因(Sex-determiningRegionontheYChromosome，SRY)被認為是在性別決定調(diào)控級聯(lián)反應中的主基因，同時繆勒氏管抑制因子(MullerianInhibitingSubstance，MIS)也是哺乳動物性別決定所必須的。MIS抑制繆勒氏管(構(gòu)

2、成雌性動物的生殖結(jié)構(gòu))的形成，有研究表明MIS基因的表達可能是被SRY調(diào)節(jié)的。對于牛性別決定方面的研究很少，牛SRY是否對牛MIS基因的啟動子有結(jié)合功能仍然不清楚，關于原核表達的牛SRY蛋白功能的研究未見報道。本實驗以牛SRY蛋白對MIS基因的表達是否有調(diào)控功能為研究目的，對牛SRY基因進行了原核表達，克隆了牛、人、鼠的MIS基因啟動子，并且研究了SRY蛋白與這些啟動子的結(jié)合功能。這些實驗必將在基因水平對奶牛進行性別控制有深遠的意義。

3、 (1)提取雄性中國荷斯坦牛的基因組DNA，根據(jù)GengBank收錄的奶牛SRY基因序列，設計了一對使擴增產(chǎn)物包括SRY基因編碼區(qū)的引物(因SRY基因為單外顯子基因，其編碼區(qū)可直接用以基因組DNA為模板的PCR反應獲得)，將擴增產(chǎn)物連接至pGEM-T載體，送至生物公司進行序列分析。結(jié)果顯示，已經(jīng)獲得了中國荷斯坦牛SRY基因的編碼區(qū)全長，基因編碼區(qū)與GeneBank收錄的奶牛SRY基因同源性達到100％。 (2)根據(jù)牛S

4、RY基因編碼區(qū)和pET-28a(+)載體設計一對分別帶有酶切位點EcoRⅠ和SalⅠ的引物，以構(gòu)建好的pGEM-T/SRY載體為模板繼續(xù)擴增SRY基因編碼區(qū)，使SRY基因編碼區(qū)兩端帶上酶切位點；將獲得的PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)載體同時進行EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，并用T4DNA連接酶連接兩種酶切產(chǎn)物，構(gòu)建表達載體pET-28a/SRY；將表達載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，送至生物公司進行序列分析，分析結(jié)果表明成功構(gòu)

5、建了pET-28a/SRY表達載體。用IPTG對含有pET-28a/SRY表達載體的E.coliBL21(DE3)進行誘導，使其表達目的蛋白SRY，對表達結(jié)果進行SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在33ku處出現(xiàn)一條濃度較大的條帶，表明目的蛋白獲得表達。用His-單抗對表達產(chǎn)物進行WesternBlot檢測，結(jié)果顯示為陽性，而對照組為陰性，進一步證明了目的蛋白SRY得到了表達。 (3)利用帶有His標簽的融合蛋白可以與Ni結(jié)合的原

6、理，用Ni-NTA蛋白純化柱對牛SRY蛋白進行純化，得到了純度較高的SRY目的蛋白。分別以牛、人、鼠的血樣為材料，進取基因組DNA；根據(jù)文獻中的牛、人、鼠的MIS基因啟動子序列，設計三對使擴增產(chǎn)物包含MIS基因啟動子的引物，并對三種啟動子進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后連接于pGEM-T載體，送至生物公司進行序列分析，結(jié)果表明獲得了三個物種的MIS基因啟動子；對獲得的啟動子用P32進行放射性標記。將標記的三種啟動子分別與純化的SRY蛋白溫浴混

7、合后進行電泳，曝光顯影，結(jié)果顯示牛和人的MIS啟動子被阻滯，而鼠的MIS啟動子沒有受到影響。 通過以上實驗確定了，原核表達的牛SRY蛋白可以與牛和人的MIS基因啟動子結(jié)合，而與鼠的MIS基因啟動子沒有結(jié)合功能。這表明牛SRY蛋白對牛MIS基因的表達有調(diào)控作用，奶牛SRY作為轉(zhuǎn)錄因子通過對其下游基因的調(diào)控來實現(xiàn)對奶牛的性別控制。牛SRY蛋白對人的MIS基因啟動子的結(jié)合表明牛與人在性別調(diào)控上具有相似的作用機制，而與鼠在性別調(diào)控方面