植物轉(zhuǎn)脂蛋白CaMBP-10結(jié)合蛋白的鑒定、克隆和表達(dá).pdf

1、白菜中發(fā)現(xiàn)的小分子堿性蛋白BP-10被證明是一種植物非特異性轉(zhuǎn)脂蛋白(nsLTPs)，也是一種不依賴于Ca2+的鈣調(diào)素結(jié)合蛋白。本實(shí)驗(yàn)室的研究證明BP-10參與了植物抗性反應(yīng)，為進(jìn)一步確定其可能的作用機(jī)制，我們首先通過蛋白組學(xué)的方法對與BP-10相互作用的蛋白進(jìn)行分離鑒定。凝膠覆蓋技術(shù)(Gel-overlay)被廣泛應(yīng)用于蛋白相互作用的研究中，本論文成功建立了堿性小分子蛋白BP-10的膠體金標(biāo)記，并通過斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)證明方法的可靠性和特異

2、性。通過凝膠覆蓋分析(Gel-overlay)從白菜蛋白粗提液中發(fā)現(xiàn)一個可與BP-10特異性結(jié)合的35kD的蛋白條帶，利用Pull-down、免疫共沉淀從白菜粗蛋白提取液中分離了這一蛋白，并對該蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，確定其是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。提取白菜總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參考GenBank中已登錄的幾種雙子葉植物GAPDH保守區(qū)域，設(shè)計(jì)簡并引物進(jìn)行RT-PCR，克隆了GAPDH基因。將獲得的GAPDH基因連接到pE

3、T32M表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Ecoil.BL21(DE3) TrxB-大腸桿菌，得到可誘導(dǎo)表達(dá)GAPDH融合蛋白的菌株。在16℃下用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得GAPDH融合蛋白，以融合蛋白為研究對象，通過凝膠覆蓋分析、凝膠過濾層析以及Pull-down等方法進(jìn)一步證明了GAPDH與BP-10存在蛋白相互作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)GAPDH是一種多功能蛋白，不僅在真核生物糖代謝中起重要作用，在一些脅迫條件下，植物GAPDH也表現(xiàn)出一定的脅迫響應(yīng)。BP-10