白菜內源蛋白激酶磷酸化非特異性轉脂蛋白CaMBP10的研究.pdf

1、植物非特異性轉脂蛋白(nsLTP)是一類廣泛存在于高等植物中的堿性小分子蛋白。早期體外試驗發(fā)現(xiàn),它們能與脂肪酸結合,并增強膜結構之間的脂分子轉移。后來的研究表明,轉脂蛋白參與了植物角質層的形成,以及針對生物和非生物脅迫的應答等生理過程。目前,其準確的生物學功能仍在爭論之中,有關轉脂蛋白功能調節(jié)的信息更是缺乏。 蛋白質的可逆磷酸化修飾是真核生物細胞生命活動調節(jié)中最常見的一種機制。本研究組曾從中國大白菜中分離了一種分子量約為10 k

2、Da的鈣調素結合蛋白,暫名CaMBP10(簡稱 BP10),并已證實BP10是植物非特異性轉脂蛋白家族的一員。本論文以白菜為實驗材料,研究了白菜內源蛋白激酶對非特異性轉脂蛋白BP10的磷酸化修飾,探討蛋白質磷酸化對轉脂蛋白功能的調節(jié)作用。 采用差速離心法,制備了白菜的胞漿可溶性蛋白和膜蛋白分別作為可溶性蛋白激酶和膜蛋白激酶的來源。利用同位素標記法,我們分別研究了白菜可溶性蛋白激酶和膜蛋白激酶磷酸化BP10的生化特征。磷酸化時間曲

3、線和免疫印跡分析表明：白菜胞漿中存在內源的可溶性蛋白激酶磷酸化BP10。進一步研究發(fā)現(xiàn),BP10的磷酸化依賴于Ca2+,而Ca2+的鰲合劑EGTA、CaM的拮抗劑W7和TFP能夠抑制胞漿激酶對BP10的磷酸化。In-gel kinase分析表明：一分子量約為45 kDa的蛋白激酶自磷酸化后能夠原位磷酸化:BP10和組蛋白H1。該45 kDa激酶自磷酸化和底物磷酸化均依賴于Ca2+,它磷酸化BP10 C-末端CaM結合結構域內的83、85

4、位絲氨酸(Ser)殘基或86位蘇氨酸(Thr)殘基。綜合上述,我們確認45 kDa蛋白激酶是植物鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)家族的成員,而BP10是CDPK的內源特異性底物。CaM凝膠覆蓋分析表明,CDPK激酶對BP10的磷酸化抑制了BP10與CaM的結合,暗示CDPK可能參與轉脂蛋白(BP10)功能的調節(jié)。為了探討nsLTP磷酸化后對其脂質結合活性的影響,我們將83、85位Ser突變?yōu)樘扉T冬氨酸(Asp),實驗結果顯示,與野生型BP1

5、0相比,突變體Ser83D/Ser85D脂質結合能力明顯增強。采用植物激素茉莉酸(JA)處理白菜后,BP10的磷酸化水平降低,而RT-PCR顯示BP10的表達水平上調。因此,茉莉酸信號通路可直接在轉錄水平調節(jié)nsLTP的表達,也可間接影響nsLTP的磷酸化修飾,從而調控nsLTP功能。另一方面,我們在膜蛋白體系內同樣發(fā)現(xiàn)了磷酸化BP10的激酶。膜蛋白激酶對BP10的磷酸化受Ca2+,EGTA,W7的影響,說明存在膜結合的CDPK磷酸化B

6、P10。膜激酶的高活性依賴于膜結構的完整性。磷酸化位點分析表明80位的酪氨酸是磷酸化的氨基酸之一,說明存在其他類型的膜蛋白激酶磷酸化BP10。進一步實驗表明,膜蛋白激酶對BP10的磷酸化同樣造成BP10結合CaM能力減弱。采用JA處理白菜后,實驗結果顯示,JA單獨不能影響B(tài)P10磷酸化水平,而JA-LTP的復合物使得BP10的磷酸化在處理后12 h達到高峰。由此,我們推測BP10在體內可能具有多種生理功能,并且受到不同細胞區(qū)域內蛋白激酶