融合多肽靶向DNA蛋白激酶自主磷酸化的放射增敏實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由輻射引起的DNA損傷的主要類型包括堿基損傷、單鏈斷裂(single strandbreaks,SSBs)和雙鏈斷裂(DSBs)。真核細(xì)胞有非常復(fù)雜的酶修復(fù)系統(tǒng)來消除這些暴露于輻射引起的損傷,堿基損傷和SSBs不被認(rèn)為是致命的損傷,因?yàn)榧词顾鼈儺a(chǎn)生的頻率比DNA雙鏈斷裂高,它們會(huì)完全和迅速地被修復(fù)。因?yàn)镈NA雙鏈斷裂修復(fù)相當(dāng)緩慢,并可能在不正確的錯(cuò)誤連接對(duì)導(dǎo)致染色體畸變,所以DSBs屬于電離輻射的致死性效應(yīng)。堿基損害和SSBs通過堿基切

2、除修復(fù)(base excisionrepair,BER)的途徑完成修復(fù)。DSBs的修復(fù)是由兩個(gè)不同的修復(fù)機(jī)制完成:被稱為非同源末端連接(NHEJ)和同源重組修復(fù)(HRR)。NHEJ通路通常被認(rèn)為是控制輻射對(duì)腫瘤細(xì)胞誘發(fā)致死性損傷得主要途徑。雖然NHEJ涉及多個(gè)蛋白質(zhì)的參與,但DNA蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs)是一個(gè)關(guān)鍵酶。當(dāng)DNA雙鏈斷裂時(shí),DNA-PKcs通過磷酸化被激活,并和它的調(diào)節(jié)亞基KU70和KU80一起穩(wěn)定地附著在DN

3、A的斷裂末端。這個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合物和其他蛋白質(zhì),如Mre11、Rad50、Nbs1、XRCC4、和DNA連接酶Ⅳ在一起完成DNA的斷裂兩端的再連接。共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變(ATM)是另一個(gè)重要的修復(fù)蛋白,DNA損傷時(shí),參與對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)的調(diào)控。
　　 DNA損傷修復(fù)機(jī)制決定細(xì)胞對(duì)放射線的內(nèi)在的放射敏感性。大多數(shù)惡性腫瘤對(duì)射線不敏感,因而導(dǎo)致照射后復(fù)發(fā)。如果能夠抑制DNA損傷后的修復(fù),則有可能使腫瘤細(xì)胞對(duì)放射敏感。近年來眾多的研

4、究都針對(duì)這一方向。Non-homologousDNA end joining(NHEJ)是一種主要DNA損傷修復(fù)機(jī)制,NHEJ需要至少六種蛋白:Ku70／Ku80異聚體、DNA-PKcs、XRCC4、DNA連接酶Ⅳ和Artemis。DNA-PKcs作為主要的酶影響DNA修復(fù)的過程,因而其可以作為一種理想的分子靶。DNA—PKcs在ABCDE(T2609、S2612、T2620、S2624、T2638及T2647),PQR(S2023、S

5、2029、S2041、S2051,S2053、S2056)等區(qū)域進(jìn)行自主磷酸化。研究證明了突變以上位點(diǎn)造成DNAPKcs自我磷酸化障礙可以影響DNAPKcs的活性而增加放射敏感性。本課題研究中,我們?cè)O(shè)計(jì)用大分子化合物融合多肽來干擾DNA-PKcs的磷酸化,從而影響DNAPKcs的活性。融合多肽由兩個(gè)功能區(qū)組成:一部分為腫瘤靶向區(qū)即入細(xì)胞區(qū)(引導(dǎo)肽):HIV1-TAT部分的氨基酸序列,即TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(氨基酸序列為:YGRKKRRQRR

6、R),具有很強(qiáng)的穿過細(xì)胞膜和核膜的功能。另一部分為分子靶向區(qū),選擇DNA-PKcs的ABCDE結(jié)構(gòu)域部分,分3個(gè)肽序列:FVET(2609)QAS(2612)QGT,QTRT(2620)QEGS(2624)LS,T(2638)QQQHDFTLT(2647)。分別與HIV1-TAT融合。
　　 我們?cè)O(shè)想:融合多肽能夠穿過細(xì)胞膜和核膜；融合多肽能夠增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性；其中融合多肽的放射增敏作用機(jī)制很可能是:通過抑制相應(yīng)位點(diǎn)絲(

7、S)、蘇(T)氨酸的自主磷酸化(Autophosphorylation)并進(jìn)一步抑制其下游的Artemis磷酸化而產(chǎn)生作用。
　　 1融合多肽的設(shè)計(jì)、合成及序列和純度的驗(yàn)證
　　 我們將蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域稱為腫瘤細(xì)胞靶向區(qū),序列選擇HIV1-TAT的一部分,氨基酸序列為:YGRKKRRQRRR,分子量為1560。分子靶向區(qū)選擇DNA-PKcs的ABCDE結(jié)構(gòu)域部分,分3個(gè)肽序列:FVET(2609)QAS(2612)QGT,

8、QTRT(2620)QEGS(2624)LS,T(2638)QQQHDFTLT(2647)。分別與HIV1-TAT融合,這樣便于分別研究三個(gè)多肽的放射增敏作用及相應(yīng)的作用機(jī)制。同時(shí)設(shè)計(jì)隨機(jī)肽序列(scrambled sequence)作為陰性對(duì)照。Biotin標(biāo)記在多肽的N-端(N-terminusof the peptides)便于觀察多肽的入胞情況(多肽具體序列及相對(duì)應(yīng)英文縮寫見圖1.1)。
　　 Biotin-TAT(BT

9、)用于觀察細(xì)胞穿膜肽TAT自身的穿胞作用,Biotin-wtDIP1(Bw1)僅為Biotin標(biāo)記的分子靶向區(qū)多肽(FvET(2609)QAS(2612)QGT),未與HIV1-TAT連接,用于觀察在沒有細(xì)胞穿膜肽TAT引導(dǎo)的情況下分子靶向區(qū)多肽是否有穿膜作用。Biotin-TAT-scDIP1(BTs1)和Biotin—TAT-scDIP2(BTs2)為與細(xì)胞穿膜肽TAT連接的兩個(gè)隨機(jī)肽。Biotin-TAT-wtDIP1(BTw1)

10、、Biotin-TAT-wtDIP2(BTw2)和Biotin-TAT-wtDIP3(BTw3)分別是HW1-TAT與FVET(2609)QAS(2612)QGT、QTRT(2620)QEGS(2624)LS和T(2638)QQQHDFTLT(2647)3個(gè)分子靶向區(qū)多肽融合后的多肽。
　　 多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程,固相合成順序一般從C端向N端合成。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生,參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是被保護(hù)的；而羧基是游

11、離的,并且在反應(yīng)之前必須活化。化學(xué)合成方法有兩種,即Fmoc和tBoc。
　　 所有合成的多肽得到產(chǎn)品后,經(jīng)ESL-MS檢測(cè)所有合成多肽的實(shí)際分子量均與各自對(duì)應(yīng)的目標(biāo)分子量接近,說明該多肽實(shí)際分子量與理論值相符,分子量正確(具體見圖1.3A-圖1.9A),序列正確。HPLC檢測(cè)分析得各樣品純度均大于95％(具體見圖1.3B-圖1.9B)。
　　 2融合多肽入胞、細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞毒作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 我們首先觀察

12、和檢測(cè)融合多肽在多個(gè)細(xì)胞系中的入胞效果,所用的細(xì)胞系包括:人腸癌細(xì)胞系RKO、SW480和人宮頸癌細(xì)胞系Hela。10μM多肽加入培養(yǎng)的細(xì)胞中60分鐘后,用免疫熒光顯微鏡評(píng)估肽的定位。應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察多肽在細(xì)胞中的滯留時(shí)間。觀察融合多肽的半衰期(half-life)。用MTT(3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)檢測(cè)和評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)多肽的細(xì)胞毒作用。用DD

13、P作為一個(gè)陽性對(duì)照藥物。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn):合成的各種多肽(10μM)加入RKO細(xì)胞后1小時(shí)后,共聚焦顯微鏡觀察多肽的入胞情況:干擾功能域(分子靶向區(qū)多肽)未能進(jìn)入細(xì)胞(胞漿或細(xì)胞核),而TAT、與TAT融合的隨機(jī)肽(BTs1和BTs1)以及與TAT融合的分子靶向區(qū)多肽(BTw1、BTw2和BTw3)明顯地被腫瘤細(xì)胞攝取。入胞后,主要分布于胞漿和細(xì)胞核。細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示:融合多肽作用4小時(shí)后,熒光強(qiáng)度開始明顯減弱(圖2.2a

14、)。各個(gè)多肽的細(xì)胞毒驗(yàn)證(MTT assay)結(jié)果顯示:按final concentraton設(shè)置的濃度加入多肽(0,5,10,20,40,60,80μM)和及陽性對(duì)照藥物順鉑(0,5,10,20,40,60,80μM),繼續(xù)培養(yǎng)48h,多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞均未表現(xiàn)出細(xì)胞毒作用(圖2.3)。而順鉑隨著加藥濃度的增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯增加。
　　 基于MTT有關(guān)細(xì)胞毒試驗(yàn)的結(jié)果,我們可以選擇10μM、20μM、30μM和40μM等

15、低于80μM濃度的多肽作為下一步一系列試驗(yàn)的工作濃度。
　　 3融合多肽對(duì)放射敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究
　　 這一部分試驗(yàn)在體外(in vitro)應(yīng)用克隆形成的方法(clony-forming assays)研究融合多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞系(主要為RKO細(xì)胞)放射敏感性的影響。通過體外實(shí)驗(yàn)測(cè)量γ-H2AX焦點(diǎn)形成(γ-H2AX focus formation)研究融合多肽對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA損傷形成損傷修復(fù)的影響。
　　 我們

16、發(fā)現(xiàn)BTw1和BTw2對(duì)放射敏感性均無影響,而BTw3能夠明顯降低放射誘導(dǎo)的細(xì)胞生存。D0值代表37％腫瘤細(xì)胞存活的致死平均照射劑量。D0值是腫瘤細(xì)胞內(nèi)在放射敏感性(intrinsic cellular radiosensi-tivity)的指標(biāo)。RKO細(xì)胞在BTw3處理后的D0值為1.95Gy,隨機(jī)肽(BTs2)處理后的Do值為2.46Gy。放射增敏比(SER)為1.25。結(jié)果提示BTw3對(duì)RKO細(xì)胞具有放射增敏作用。
　　

17、在0小時(shí)間點(diǎn),未檢測(cè)到γ-H2AX焦點(diǎn),在照射0.5小時(shí)后,各組的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)明顯增加,且各組在0.5時(shí)間點(diǎn)的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)無明顯差異(P>0.05)。在1小時(shí)時(shí)間點(diǎn)BTw3組的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)明顯多于BTs1組(P=0.032),但與和BTs2組相比無明顯差異(P=0.132)。在這一時(shí)間點(diǎn),BTw3組的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)均明顯多于BTw1和BTw2組(P分別為0.031和0.009)。在2、4、8、24和48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)

18、,BTw3組的γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)明顯多于其他各組(單純照射、BTs1、BTs2、BTw1和BTw2組)(P均小于0.00001)。根據(jù)結(jié)果我們可以推測(cè):融合多肽加放射沒有誘導(dǎo)或增加γ-H2AX焦點(diǎn),但BTw3可能推遲了DNA雙鏈斷裂修復(fù)的時(shí)間,因而延長(zhǎng)了γ-H2AX焦點(diǎn)存在的時(shí)間。結(jié)果提示BTw3對(duì)RKO細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)有抑制作用。
　　 總之,克隆形成試驗(yàn)和γ-H2AX foci試驗(yàn)結(jié)果均支持BTw3(T(2638)QQ

19、QHDPTLT(2647))對(duì)RKO細(xì)胞具有潛在的放射增敏作用。
　　 4融合多肽(TAT-QQQHDFTLT)放射增敏的分子生物學(xué)機(jī)制研究
　　 基于以上結(jié)果,我們進(jìn)一步研究了BTw3對(duì)其對(duì)應(yīng)的蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化的影響(如對(duì)T2647位點(diǎn)磷酸化的影響),以及BTw3對(duì)DNA—PKcs下游分子Artemis磷酸化的影響,以及BTw3對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡Caspase家族關(guān)鍵的執(zhí)行分子caspase-3的影響。
　　 結(jié)果

20、提示:在照射20分鐘時(shí),DNA-PKcs T2647磷酸化程度變化不明顯,然而在照射60分鐘后,我們觀察到DNA-PKcs分子T2647磷酸化程度明顯降低(見圖4.1)。
　　 我們研究Artemis蛋白對(duì)于電離輻射的效應(yīng),具體觀察了融合多肽BTw3(TAT-T(2638)QQQHDFTLT(2647))聯(lián)合放射對(duì)Artemis S516磷酸化的的影響,用Artemis S516磷酸化特異性抗體來檢測(cè)和分析Artemis蛋白磷酸

21、化的變化。結(jié)果顯示:BTw3處理RKO細(xì)胞后照射10Gy,在照射后30分鐘和60分鐘,融合多肽BTw3明顯抑制了Artemis S516磷酸化。
　　 細(xì)胞凋亡分析caspase-3的變化結(jié)果顯示:BTw3聯(lián)合放射與單獨(dú)放射相比,可以明顯增加cleaved caspase-3蛋白表達(dá),說明BTw3可以進(jìn)一步促進(jìn)放射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1)MS分析各多肽的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定值與理論值相符。證明序列正

22、確。確保了所合成的肽為高純度目的肽。
　　 2)HPLC對(duì)合成多肽進(jìn)行的純度分析顯示,所有合成多肽的純度均在95％以上,符合高純度多肽的合成要求。
　　 3)TAT或融合其他短肽時(shí)可穿膜進(jìn)入細(xì)胞,并可定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,同時(shí)具有較高的入胞效率。而非穿膜肽則不能進(jìn)入細(xì)胞。
　　 4)BTw1和BTw2對(duì)放射敏感性均無影響,而BTw3能夠明顯降低RKO細(xì)胞放射后的細(xì)胞生存。即BTw3對(duì)RKO細(xì)胞有潛在的放射增敏作用

23、。
　　 5)BTw3明顯延長(zhǎng)了放射誘導(dǎo)γ-H2AX焦點(diǎn)(γ-H2AX foci)存在的時(shí)間
　　 6)克隆形成試驗(yàn)和γ-H2AX foci試驗(yàn)結(jié)果均支持BTw3(T(2638)QQQHDFTLT(2647))對(duì)RKO細(xì)胞具有潛在的放射增敏作用。
　　 7)BTw3(LAT-T(2638)QQQHDFTLT(2647))可以抑制放射誘導(dǎo)的RKO細(xì)胞DNA—PKcs分子T2647的磷酸化。
　　 8)BTw