家蠶ZP(zona pellucida)domain基因dusky的克隆、表達(dá)與功能研究.pdf

1、ZP是zona pellucida的縮寫，ZP基因是指包含ZP功能域的一群基因。ZP功能域包含約260個(gè)氨基酸，其中有8-10個(gè)保守的半胱氨酸(Cys)殘基。ZP蛋白大多數(shù)是糖基化的蛋白，其功能多種多樣，從精子受體到結(jié)構(gòu)原件的動(dòng)力傳導(dǎo)器，從卵殼的主要成分到參與信號(hào)傳導(dǎo)，以及哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物的各種受體。ZP功能域的突變會(huì)引起蛋白質(zhì)功能的缺失以及很多的疾病。因此，許多ZP蛋白都引起了人們的高度關(guān)注，因?yàn)樗鼈冊(cè)谔囟ńM織大量表達(dá)，并且和很多

2、人類疾病相關(guān)。 翅的發(fā)生使昆蟲在覓食、尋偶、擴(kuò)大分布和避敵等多方面獲得了優(yōu)越的競爭能力，是昆蟲綱成為最繁榮的生物類群的重要原因。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式代表，又是目前完成基因組測序的唯一的一種鱗翅目昆蟲，其ZP基因，尤其是在翅中的研究還未見相關(guān)報(bào)道。本研究在家蠶基因組中鑒定出了一群ZP基因，并對(duì)它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。同時(shí)為了研究ZP基因在家蠶翅中的作用，克隆了其中一個(gè)dusky基因，對(duì)其在家蠶不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行了檢測，并

3、采用RNAi技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究，獲得結(jié)果如下： 1、家蠶ZP基因家族的生物信息學(xué)分析 已報(bào)道在果蠅中有16個(gè)ZP基因，其中部分基因的功能在果蠅中有相關(guān)的研究。通過同源檢索，我們發(fā)現(xiàn)這16個(gè)基因在家蠶基因組中均存在同源基因。其中部分基因的功能在果蠅中有相關(guān)的研究。通過分析家蠶ZP基因的結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)發(fā)現(xiàn)其和果蠅ZP基因的結(jié)構(gòu)域非常相似。通過進(jìn)化分析還發(fā)現(xiàn)它們的進(jìn)化關(guān)系也比較對(duì)應(yīng)。這一結(jié)果表明，ZP基因在鱗翅目和雙翅目昆

4、蟲中還是比較保守的。另外，還基于家蠶基因組數(shù)據(jù)對(duì)家蠶ZP基因在染色體上的位置特點(diǎn)進(jìn)行了分析，通過芯片數(shù)據(jù)對(duì)其表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了分析。 2、家蠶dusky基因的克隆及序列分析 在對(duì)家蠶基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物克隆了家蠶dusky基因的全長CDS序列。結(jié)果表明，家蠶dusky基因是單外顯子基因，ORF長1398bp，編碼465個(gè)氨基酸。物種間同源蛋白質(zhì)序列的比對(duì)結(jié)果表明，家蠶同其他不同物種間的dusky基因

5、的ZP domain序列保守，且都能找到10個(gè)半胱氦酸殘基。 3、家蠶dusky基因的mRNA表達(dá)模式 家蠶dusky基因在在家蠶不同組織中的表達(dá)檢測結(jié)果表明，其基因在家蠶5齡第6天幼蟲的頭部、體壁、卵巢、精巢、馬氏管、絲腺、血液、脂肪體和中腸中都沒有表達(dá)，而在翅原基中卻有大量表達(dá)，這一結(jié)果說明dusky基因在家蠶翅發(fā)育過程中特異表達(dá)，推測dusky基因?qū)倚Q翅的發(fā)育有重要作用。家蠶dusky基因在在家蠶翅發(fā)育中的表達(dá)檢

6、測結(jié)果說明，dusky基因在幼蟲和蛹前期的家蠶翅中都有表達(dá)，而在蛹后期和化蛾后沒有表達(dá)。 4、家蠶dusky基因在翅發(fā)育中的RNAi研究 本實(shí)驗(yàn)對(duì)dusky基因在家蠶翅中進(jìn)行了RNAi干涉實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，家蠶dusky基因被干涉后，翅表現(xiàn)為小翅的表型。同時(shí)，對(duì)干涉后翅的毛孔進(jìn)行的掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，毛孔有變密的趨勢。最后，通過定量PCR的方法對(duì)干涉后dusty基因的表達(dá)作了分子水平的檢測，結(jié)果表明dusky基因被干涉后表達(dá)