家蠶BmPLA2和BmRab3基因的分子克隆、表達和功能研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　Part-Ⅰ 含WD40保守域并導致脂肪體消融的家蠶BmPLA2的分子克隆、表達和體內干擾
　　PLA2是參與水解花生四烯酸以及其他多種不飽和脂肪酸的超級酶家族中的一員，這些酶從sn-2位置釋放出自由的花生四烯酸和一個溶血磷脂。目前對PLA2在脊椎動物上的研究主要是借助于細菌感染的炎癥免疫應答反應。PLA2酶包含最大的磷脂酶類，參與體內脂質信號分子如花生四烯酸的體內釋放。已有關于PLA2

2、在免疫相關組織如血細胞和脂肪體上的活性研究。在本文中，我們克隆了家蠶脂肪體的PLA2相關基因，命名為BmPLA2。該基因全長1.031kb，編碼37.64 kDa的蛋白質。生物信息學分析此蛋白質含有一個假想的WD40保守結構域，與Danaus plexippus同源。在我們所研究的家蠶組織中，BmPLA2在五齡第3天家蠶的脂肪體高表達，皮膚組織中低表達。我們還研究了BmPLA2在較早齡期幼蟲中的差異表達，同時發(fā)現(xiàn)該基因雌蛹表達量高于雄蛹

3、。RNAi介導的基因沉默結果顯示干擾24h、48h、72h后BmPLA2表達量明顯降低，同時觀察到干擾后的幼蟲和蛹表現(xiàn)出成蟲致死和不發(fā)育。另外，我們還觀察了經RNAi誘導后的幼蟲脂肪體細胞的形態(tài)特征，為BmPLA2基因及其功能的進一步研究作了探討。
　　Part-Ⅱ C端具有GGT2結合位點的BmRab3在家蠶中部絲腺的高度表達
　　酵母Ypt1和含有哺乳動物Rab（Ras相關蛋白發(fā)現(xiàn)與腦部）GTPase的Sec4蛋白被發(fā)現(xiàn)

4、已有二十年，它們在進化上高度保守，并且是重要的膜運輸調節(jié)因子。RabGTPase是被稱為Ras GTPases超級家族的成員。目前，Ras家族中已有超過70個的Rab及Rab類似物被報道。很明顯地，Rab GTPases作為一種分子開關，以活性和非活性兩種狀態(tài)循環(huán)，實際上起到了整合雙層膜運輸結構和細胞間信號傳導的作用。雖然它們分子結構較小，但Rab GTPases具有多個互作位點，而且它們在功能和結構上的交互作用機制是非常重要的。此家族

5、其中一個成員Rab3 GTPase在囊泡運輸過程中起重要作用，除了在脂肪細胞、周緣組織和外分泌腺中的活性之外，其高表達于腦部及內分泌腺。有趣的是，像家蠶等鱗翅目昆蟲絲腺在轉化醫(yī)學及其他研究中成為重要的研究材料。在絲蛋白的諸多機制尚不明確的情況下，本文通過熒光定量PCR方法，首次報道了BmRab3基因在家蠶中部絲腺的高表達。生物信息學分析，此基因的理論等電點5.52，蛋白分子量24.3 kDa.BmRab3含有C端GGT2結合位點，并包含

6、兩個推定的GEF/GDI作用位點。多重序列比對發(fā)現(xiàn)其與其他物種Rab3的高度相似性。進化樹分析BmRab3位于T.castanium和A.aegypti之間。除其他的家蠶組織以外，我們還分別測得了該基因在中部絲腺，后部絲腺以及整個的絲腺中表達了BmRab3基因。結果顯示，BmRab3在中部絲腺的表達高于后部絲腺和整個絲腺組織。此外，BmRab3在早期家蠶幼蟲的表達趨勢不同，并且在雄蛹的表達量高于雌蛹。活體BmRab3 dsRNA干擾顯示