家蠶絲腺高豐度表達(dá)基因Bmtdh和Bmsps1的克隆和功能分析.pdf

1、家蠶絲腺是昆蟲中蛋白質(zhì)合成能力最強(qiáng)的生物器官，能在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)高效表達(dá)合成蠶絲蛋白，是研究基因時(shí)空特異性表達(dá)調(diào)控機(jī)制的理想材料。蠶絲蛋白由絲素和絲膠2部分組成，其表達(dá)合成過程有眾多基因和相關(guān)調(diào)節(jié)因子的參與。直接編碼絲素蛋白的基因有fib-L、fib-H和P25共3個(gè)，已被深入研究。已經(jīng)分離克隆的編碼絲膠蛋白的基因有Serl、Ser2、S3、S4和S5共5個(gè)。其他一些與蠶絲蛋白合成相關(guān)的基因和調(diào)節(jié)因子主要有：SGF-B、BmFA、Ub2

2、a和Ub2b復(fù)合體、TRIO復(fù)合體和PSGF調(diào)節(jié)蛋白等絲腺特異轉(zhuǎn)錄因子，tRNAAla、tRNALys、tRNAGlu、tRNAPhe和tRNAGly等tRNA基因及其轉(zhuǎn)錄因子TFIIIR，真核翻譯延長因子Ⅰ和其他一些特異調(diào)節(jié)因子。這些基因和相關(guān)因子的發(fā)現(xiàn)為闡明蠶絲蛋白的表達(dá)調(diào)控機(jī)制作了很好的嘗試，但由于這一機(jī)制的復(fù)雜性，仍有許多未明之處有待繼續(xù)深入研究。 為進(jìn)一步闡明蠶絲蛋白的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，在家蠶基因組和大量EST數(shù)據(jù)分析的基

3、礎(chǔ)上，本論文選擇了可能參與蠶絲蛋白合成過程的2個(gè)基因Bmtdh和Bmspsl，對(duì)它們進(jìn)行了克隆和序列分析，用RT-PCR試驗(yàn)分析了它們的時(shí)空表達(dá)特性，并在大腸桿菌中嘗試了Bmspsl基因的誘導(dǎo)表達(dá)，獲得結(jié)果如下： 1.Bmtdh基因的序列和結(jié)構(gòu)Bmtdh基因編碼家蠶的蘇氨酸脫氫酶(TDH酶)，克隆的該基因cDNA長1310bp(登錄號(hào)：ABA43639.1)，包括227bp5’-UTR序列，在基因組中單拷貝存在。其外顯子有3個(gè)，

4、其中Extron1長333bp，位于Scaffold006584上；Extron2和Extron3長度分別為791bp和186bp，均位于Scaffold003119上。第2內(nèi)含子長1365bp，位于Scaffold003119上；第1內(nèi)含子因跨2個(gè)Scaffold而不能確定。其ORF長1026bp，編碼342個(gè)氨基酸，預(yù)測其蛋白質(zhì)的分子量為39.1kDa，含有4個(gè)Cys，可形成2個(gè)二硫鍵，等電點(diǎn)為8.69。 2.Bmtdh基因

5、的保守功能域和系統(tǒng)進(jìn)化分析Bmtdh基因的推導(dǎo)氨基酸序列含有一個(gè)完整的表面異構(gòu)酶功能域(Ile29-Val322.)，具有NAD+結(jié)合特性，說明Bmtdh基因的編碼蛋白具有表面異構(gòu)酶活性。比較家蠶與其他物種TDH酶的同源性表明，其與果蠅、按蚊和蜜蜂的相似性分別為90﹪、91﹪和88﹪，與家豬和小鼠的相似分別為77﹪和75﹪，而與大腸桿菌的相似性僅為41﹪。利用包括家蠶在內(nèi)的33個(gè)物種的TDH酶氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，能很好地反映這些

6、物種在進(jìn)化上的親緣關(guān)系。 3.Bmtdh基因的RT-PCR分析對(duì)5齡3天6個(gè)組織的RT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bmtdh基因在家蠶的絲腺和卵巢中的轉(zhuǎn)錄水平都很高，在中腸、血液、脂肪體、馬氏管4個(gè)組織中的轉(zhuǎn)錄水平較低，這與EST數(shù)據(jù)的分析結(jié)果基本相同。11個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的RT-PCR試驗(yàn)表明，Bmtdh基因在4齡眠期、5齡1天和5齡3天三個(gè)發(fā)育時(shí)期的絲腺中轉(zhuǎn)錄水平都很高，而在此前的8個(gè)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平都比較低，其中再卵期(G2胚胎)和

7、1齡2天兩個(gè)發(fā)育時(shí)期沒有轉(zhuǎn)錄。 4.Bmspsl基因的序列和結(jié)構(gòu)Bmspsl基因編碼家蠶的硒磷酸合成酶Ⅰ(SPSl)，克隆的cDNA長1817bp(登錄號(hào)：ABA43640.1)，包括256bp5'-UTR序列和1209bp的完整ORF，其3’-UTR序列由家蠶同源EST拼接得到。應(yīng)用BLASTN程序檢索家蠶基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)Bmspsl基因只有一個(gè)拷貝，位于Scaffold005966上，且沒有內(nèi)含子。用克隆ORF序列的引物，

8、以家蠶基因組DNA作模板進(jìn)行PCR試驗(yàn)，結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)Bmspsl基因沒有內(nèi)含子存在。 5.Bmspsl基因的保守功能域和系統(tǒng)進(jìn)化分析家蠶Bmspsl基因的推導(dǎo)氨基酸序列包含2個(gè)功能域：SelDN(Leu45-Pro208，E=4e-49)和AIRS_C(Gly220-Asp391，E=8e-10)。SelD_N是硒磷酸合成酶N末端結(jié)構(gòu)域，具有典型的ATP結(jié)合特性；AIRS_C是AIR合酶相關(guān)蛋白C末端結(jié)構(gòu)域。因此家蠶Bmsp

9、sl基因的編碼蛋白屬于AIR合酶家族，具有硒磷酸合成酶的結(jié)構(gòu)特征。比較家蠶與其他物種SPSl蛋白之間的同源性顯示，其與果蠅、人和線蟲的相似性分別為94﹪、86﹪和66﹪，而與大腸桿菌的相似性僅為42﹪。用包括家蠶在內(nèi)的32個(gè)物種的SPSI蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，32個(gè)物種在總體上分成3大類群：細(xì)菌，古細(xì)菌和真核生物。在真核生物中，昆蟲和脊椎動(dòng)物分別獨(dú)立聚類成為2個(gè)亞群，而原生動(dòng)物沒能聚類在一起。 6.Bmspsl基因

10、的RT-PCR分析對(duì)5齡3天6個(gè)組織的RT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bmspsl基因在家蠶絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平很高，在中腸、血液、脂肪體、馬氏管、卵巢5個(gè)組織中的轉(zhuǎn)錄水平較低，這與EST數(shù)據(jù)的分析結(jié)果也完全吻合。11個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的RT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bmspsl基因在發(fā)育后期(4齡眠期、5齡l天和5齡3天)的絲腺中一直維持較高的轉(zhuǎn)錄水平，在卵期、1齡眠期和2齡2天時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平也比較高，其他5個(gè)發(fā)育時(shí)期卻很低。 7.Bmspsl基因的原