家蠶絲腺高表達(dá)基因BmeIF5A、BmCyPA的克隆與分析.pdf

1、利用生物基因組進(jìn)化中的保守性，具有某一功能的基因在不同物種之間常具有一定的同源性，有目的的克隆基因家族新成員，已經(jīng)成為新基因克隆的有效策略。同時(shí)，結(jié)合基因表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行基因表達(dá)分析，對(duì)于發(fā)現(xiàn)組織特異表達(dá)基因具有重要指導(dǎo)作用。家蠶絲腺是合成和分泌絲蛋白的主要器官，是所有生物中最具活力的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的代表，也是理想的生物模型。本論文研究分為三個(gè)方面：第一、二兩方面利用同源策略和家蠶EST數(shù)據(jù)，分別從家蠶絲腺克隆得到新的家蠶真核生物翻譯啟

2、始因子BmeIF5A和親環(huán)蛋白基因BmCyPA，并進(jìn)行了功能和結(jié)構(gòu)的初步研究；第三方面在全基因組水平對(duì)家蠶親環(huán)蛋白基因家族進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能分析。 家蠶BmeIF5A基因具有3個(gè)外顯子2個(gè)內(nèi)含子，推導(dǎo)開放閱讀框由160個(gè)氨基酸組成，編碼分子量為17.5kD，等電點(diǎn)為5.16的蛋白。該基因編碼的蛋白質(zhì)具有保守的hypusine修飾區(qū)域，與其他物種來源的42個(gè)eIF5A基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果表明eIF5A基因在系統(tǒng)發(fā)生樹中同一物種

3、聚在一起，物種之間分群，家蠶BmeIF5A基因表現(xiàn)出高度的序列保守性，在進(jìn)化上與親緣關(guān)系接近的幾種昆蟲分為一枝。3'RACE研究發(fā)現(xiàn)另一具有不同3'UTR的基因BmeIF5A-2，與BmeIF5A具有相同的編碼區(qū)序列，表明家蠶eIF5A基因具有兩種剪接形式。家蠶7組織中的表達(dá)譜分析顯示，BmeIF5A基因以絲腺表達(dá)豐度最高，與EST數(shù)據(jù)一致。分析表明BmeIF5A的高表達(dá)豐度可能與絲蛋白起始合成有關(guān)，并且可能影響絲腺細(xì)胞存活。

4、家蠶BmCyPA基因由2個(gè)外顯子1個(gè)內(nèi)含子組成，推導(dǎo)開放閱讀框編碼由165個(gè)氨基酸組成，編碼分子量為19.4kD，等電點(diǎn)為8.79的蛋白。3'RACE研究得到近全長的序列。序列分析表明家蠶BmCyPA基因具有高度的保守性，具有與CsA側(cè)鏈結(jié)合的氨基酸及肽酰脯氨酸順反異構(gòu)酶活性位點(diǎn)，表明可能具有肽酰脯氨酸順反異構(gòu)酶活性和與CsA結(jié)合特性。CyP基因在系統(tǒng)發(fā)生上首先按照基因定位分為兩群，各群里同一物種聚在一起，在進(jìn)化上家蠶BmCyPA與昆蟲

5、分為一小枝。家蠶7組織中的表達(dá)譜分析顯示，BmCyPA在絲腺高豐度表達(dá)，與EST數(shù)據(jù)一致。分析提示BmCyPA基因在絲腺高豐度表達(dá)可能對(duì)絲蛋白在折疊的啟始過程中形成有活性的空間結(jié)構(gòu)非常必要，進(jìn)而影響絲蛋白分泌效率。 家蠶親環(huán)蛋白(CyP)基因家族在全基因組水平由18條相似序列組成。我們從中克隆得到了新的重要基因BmCyPB，7組織表達(dá)譜分析顯示在中腸、脂肪體兩組織特異表達(dá)。CyP基因系統(tǒng)發(fā)生分析顯示CyP家族基因按照基因定位分為

6、兩個(gè)群，家蠶BmCyPA、BmCyPB分別位于兩個(gè)群。家蠶CyP基因家族與人CyPA在氨基酸序列上具有較高的同源性。結(jié)構(gòu)域分析顯示家蠶CyP基因家族可分為SD和MD兩類，無根進(jìn)化樹將18個(gè)家族基因分為兩枝。我們根據(jù)功能元件相似性預(yù)測(cè)了SD和MD基因的功能，同樣預(yù)測(cè)了線粒體cyclophilin基因的功能。還通過序列氨基酸位點(diǎn)的置換、缺失和插入分析推測(cè)位于胞質(zhì)cyclophilin基因的功能差異，這些功能差異使蛋白質(zhì)在三維結(jié)構(gòu)上發(fā)生或小或