高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵因素分析.pdf

1、家蠶是鱗翅目昆蟲的典型代表，作為第二大模式昆蟲，它不僅有著重要的研究價(jià)值，而且可以帶來可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成功建立是生命科學(xué)領(lǐng)域的里程碑，它頻繁的被用于改變生物的性狀以及通過這種技術(shù)在生物體中表達(dá)一些珍貴的外源蛋白。PiggyBac轉(zhuǎn)座子是最具吸引力的轉(zhuǎn)座原件之一，它已經(jīng)廣泛的被應(yīng)用于十多種生物的研究。PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為家蠶的轉(zhuǎn)基因研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。家蠶絲腺有著驚人的蛋白合成和分泌的能力，是一種非常理想

2、的生物反應(yīng)器。經(jīng)過數(shù)十年的努力，研究人員已經(jīng)創(chuàng)建了家蠶中部和后部絲腺生物反應(yīng)器。這些生物反應(yīng)器已經(jīng)成功表達(dá)了數(shù)十種外源蛋白。然而，現(xiàn)有的家蠶絲腺生物反應(yīng)器效率依舊不高，主要體現(xiàn)在piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率低、外源蛋白表達(dá)量較低、以及理想的轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體篩選較復(fù)雜等等，這幾個(gè)問題成為了建立高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器所面臨的最大障礙。因此，提高轉(zhuǎn)基因效率、提高外源基因表達(dá)量以及創(chuàng)建一種快速外源基因高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體篩選方法顯得

3、尤為重要。本文就針對(duì)這些科學(xué)問題展開了一系列的研究，取得的主要成果歸納如下:
　　1、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白介導(dǎo)piggyBac轉(zhuǎn)麈子的商效轉(zhuǎn)座
　　針對(duì)piggyBac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因效率不高這個(gè)問題，本研究創(chuàng)建了一種有效提高轉(zhuǎn)座效率的新方法，該方法的核心是構(gòu)建一個(gè)類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白（transcription activator-like effector，TALE）和piggyBac轉(zhuǎn)座酶（PBase）的融合蛋白（TA

4、LE-PBase）。實(shí)驗(yàn)證明TALE-PBase融合蛋白可以顯著地將轉(zhuǎn)座效率提高到63.9％，這相當(dāng)于是目前轉(zhuǎn)座效率平均水平的7倍。而且新方法的轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)中的陽性個(gè)體數(shù)每區(qū)平均達(dá)到近18條，比目前家蠶轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的平均水平最大提高了5.7倍。TALE-PBase融合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅提高了轉(zhuǎn)基因陽性蛾區(qū)數(shù)，而且也明顯提高了陽性蛾區(qū)中的陽性個(gè)體數(shù)。這兩方面的提高是piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的巨大突破，為今后的轉(zhuǎn)基因研究

5、提供了很好的技術(shù)支撐。
　　2、家蠶絲膠1啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與活性分析
　　啟動(dòng)子是調(diào)控目的基因時(shí)空表達(dá)重要的調(diào)控原件之一。然而，絕大多數(shù)的研究將目光放在了核心啟動(dòng)子或近端啟動(dòng)子區(qū)域，而近端啟動(dòng)子5'端的序列常常被人們所忽視。本研究就4kb長度的家蠶絲膠1（sericin1，Ser1）啟動(dòng)子序列通過生物信息學(xué)方法預(yù)測到種類眾多的潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，采用轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列包含的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)越多且種類越豐富時(shí)，啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)

6、錄活性就越強(qiáng)大。但是重復(fù)的近端啟動(dòng)子多個(gè)拷貝組合并不能提高下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，而且重復(fù)的近端啟動(dòng)子拷貝數(shù)越多，下游基因的轉(zhuǎn)錄水平反而越低。結(jié)果說明，4kb長度的Ser1啟動(dòng)子要比其短的啟動(dòng)子活性要高，重復(fù)的近端啟動(dòng)子多個(gè)拷貝組合并不能提高下游基因轉(zhuǎn)錄活性。這個(gè)結(jié)果為今后構(gòu)建高效家蠶絲腺生物反應(yīng)器時(shí)選擇合適長度的啟動(dòng)子提供了參考。
　　3、PiggyBac轉(zhuǎn)座子在家蠶基因中的定向轉(zhuǎn)座
　　轉(zhuǎn)座子的隨機(jī)轉(zhuǎn)座時(shí)常不利于外源基因的表

7、達(dá)，而且可能會(huì)引起內(nèi)源基因的突變。TALE-PBase融合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座理論上有可能實(shí)現(xiàn)定向轉(zhuǎn)座。PBase通過TALE靶向蛋白的牽引到達(dá)目的位點(diǎn)，從而在目的位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)定向轉(zhuǎn)座。通過研究我們發(fā)現(xiàn)了TALE-PBase介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座改變了piggyBac轉(zhuǎn)座子原先完全隨機(jī)插入的特性，而是變的更加具有傾向性，但還沒有得到真正定向轉(zhuǎn)座的結(jié)果。我們還在71個(gè)轉(zhuǎn)座家蠶中發(fā)現(xiàn)了2對(duì)插入位點(diǎn)一樣的家蠶，這種現(xiàn)象在常規(guī)的piggyBac轉(zhuǎn)座研究中是非常罕見的

8、。由此可見，TALE對(duì)PBase在一定程度上起到了靶向引導(dǎo)作用，這為今后在個(gè)體水平實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)轉(zhuǎn)座提供了寶貴的參考價(jià)值。
　　4、TALEN介導(dǎo)的家蠶同源重組
　　家蠶受精卵相當(dāng)于家蠶的早期個(gè)體，相比細(xì)胞，它更能反應(yīng)生命的真實(shí)情況。因此，用家蠶受精卵進(jìn)行同源重組(homologous recombination，HR)實(shí)驗(yàn)可以反應(yīng)個(gè)體水平同源重組的發(fā)生概率。同源重組精確的基因組編輯能力可以彌補(bǔ)其它基因組打靶技術(shù)的不足，而且也可以

9、解決piggyBac轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組這一問題。但同源重組的低效率現(xiàn)象是阻礙其廣泛應(yīng)用的一個(gè)限制因素。本研究采用蠶卵為材料，將TALEN mRNA和供體同源重組質(zhì)粒注射到產(chǎn)卵8h的家蠶受精卵內(nèi)，經(jīng)72 h后進(jìn)行TALEN打靶效率的鑒定以及同源重組效率的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TALEN在顯微注射后72h就已經(jīng)對(duì)靶位點(diǎn)產(chǎn)生了明顯突變，在檢測的15組樣品中有12組出現(xiàn)了明顯打靶，打靶效率達(dá)到80％。并且在15組受精卵中成功檢測到3組包含陽性的同源重

10、組個(gè)體，同源重組效率達(dá)到20％。這種蠶卵早期的TALEN打靶效率以及同源重組效率的檢測可以在短期內(nèi)評(píng)判實(shí)驗(yàn)的可行性，為后續(xù)陽性同源重組個(gè)體的篩選提供保障。同時(shí)也證明采用TALEN mRNA和供體同源重組質(zhì)粒組合可以實(shí)現(xiàn)精確的基因組編輯。
　　5、外源基因表達(dá)效率的輔助檢測
　　雖然piggyBac轉(zhuǎn)座子是以隨機(jī)的方式插入基因組，但是將外源基因表達(dá)框和標(biāo)志基因表達(dá)框以相同轉(zhuǎn)錄方向緊密的構(gòu)建在一起時(shí)，我們相信印使在不同的插入位點(diǎn)

11、，兩個(gè)表達(dá)框受到來自基因組的影響是相近的。我們構(gòu)建了螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，F(xiàn)Luc）和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，EGFP）兩個(gè)相鄰的基因，作了轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)分析，結(jié)果表明即使插入位點(diǎn)不同，這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平總是顯著相關(guān)的。ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示EGFP的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平同樣也是顯著相關(guān)。所以，外源基因的表達(dá)水平可以通過檢測標(biāo)志基因(EGFP)的表達(dá)水平來簡單的