家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)手足口病疫苗EV71的研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是一種被馴化和利用5000年之久的重要經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，在我國(guó)農(nóng)業(yè)、工業(yè)及科學(xué)研究中都占有重要的地位。絲腺是家蠶合成和分泌絲蛋白的特化器官，絲蛋白在五齡后期隨核內(nèi)有絲分裂大量合成，以絲狀物形式高效分泌出來(lái)，結(jié)成一個(gè)重約0.5g的蠶繭。由于具有高效的蠶絲生產(chǎn)能力，加之飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，家蠶成為合成和生產(chǎn)外源蛋白的理想生物反應(yīng)器。
　　近年來(lái)，整個(gè)亞太地區(qū)，特別在中國(guó)手足口病（Hand, foot a

2、nd mouth disease,HFMD）的爆發(fā)和流行，嚴(yán)重威脅著這一地區(qū)嬰幼兒的健康。目前針對(duì)此病還沒(méi)有特別有效的治療藥物，亟需開(kāi)發(fā)一種抗原譜廣、免疫原性高、安全穩(wěn)定的疫苗，是預(yù)防這一疾病的根本措施。
　　本論文利用含有 piggyBac轉(zhuǎn)座子基礎(chǔ)元件的原始質(zhì)粒，構(gòu)建了中部絲腺組織與時(shí)空特異表達(dá)手足口病疫苗的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒，采用胚胎顯微注射技術(shù)，經(jīng)過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性品系。為了提高外源蛋白的分離純化效率，通過(guò)獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶品

3、系與絲膠繭突變體 Nd-s品系雜交和篩選，我們得到了絲膠繭陽(yáng)性品系。從個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和Inverse PCR結(jié)果可知，所轉(zhuǎn)外源基因不影響家蠶幼蟲(chóng)個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育。RT-PCR和QPCR的結(jié)果顯示目標(biāo)基因VP1在中部絲腺特異性地高表達(dá)。SDS-PAGE和western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明VP1蛋白的成功表達(dá)。在探索 VP1蛋白的分離純化條件時(shí)，首先通過(guò)陽(yáng)性絲膠繭不同處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)，我們得到絲膠繭的最適處理時(shí)間為60h。然后對(duì)比

4、濃縮過(guò)的正常陽(yáng)性繭和直接提取的絲膠繭的外源蛋白的提取效率，結(jié)果顯示，每個(gè)絲膠繭和正常陽(yáng)性繭中的VP1蛋白分別為41.7μg和9.8μg。根據(jù)目標(biāo)蛋白大小，首先將上述兩樣品的總蛋白通過(guò)50kd的濃縮柱，再將過(guò)濾液通過(guò)30kd的濃縮柱，如此重復(fù)濃縮純化3-5次，通過(guò)分子篩的原理即可得到比較純凈的VP1蛋白。通過(guò)和BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（1、2和5μg）對(duì)比，SDS-PAGE結(jié)果顯示，每個(gè)絲膠繭和正常陽(yáng)性繭得到目標(biāo)蛋白分別為500ng和550ng，

5、純度分別為90％和70%。后經(jīng)過(guò)ELISA活性檢測(cè)，VP1抗原蛋白可以很好地和EV71VLP綜合性抗體和mD5單克隆抗體結(jié)合，顯示出良好的生物活性。以上結(jié)果證明了 VP1蛋白成功高效地表達(dá)并分泌到絲膠繭中。
　　為了提高VP1外源蛋白的表達(dá)量，我們嘗試?yán)肅RISPR/Cas9介導(dǎo)的定點(diǎn)整合技術(shù)將VP1和紅色熒光蛋白的表達(dá)框序列定點(diǎn)插入到sericin1基因的翻譯起始位點(diǎn)，然后借助 ser1基因內(nèi)源啟動(dòng)子活性以及多線染色體的核內(nèi)有