提高家蠶生物反應(yīng)器外源蛋白表達(dá)量的方法探索.pdf

1、家蠶這種模式生物以其獨特的優(yōu)勢，一直備受科學(xué)界的青睞。轉(zhuǎn)基因技術(shù)日趨成熟完善，為利用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)外源珍貴蛋白提供了條件。PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有低毒、可承載大片段的外源基因以及精確轉(zhuǎn)座，不留下轉(zhuǎn)座印跡的特點，被廣泛的應(yīng)用到多種生物的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒炛?。但常?guī)的研究中，由于PiggyBac載體多數(shù)含有兩個表達(dá)框，具有較多的元件和相同的酶切位點，所以，每次表達(dá)不同的外源基因時，需要從頭構(gòu)建質(zhì)粒，組裝啟動子、信號肽、外源基因、polyA等

2、結(jié)構(gòu)，構(gòu)建質(zhì)粒的過程費時費力，降低轉(zhuǎn)基因的工作效率。除此之外，雖然許多研究者利用家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白，縱觀這些研究成果，我們發(fā)現(xiàn)外源蛋白的表達(dá)量較低，沒有達(dá)到預(yù)期的效果。本研究針對該現(xiàn)狀，主要從三方面解決上述問題。
　　針對構(gòu)建donor質(zhì)粒工作繁瑣的問題，本研究構(gòu)建了三種通用型質(zhì)粒，以PiggyBac轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)并帶有Amp抗性基因，包括PiggyBac轉(zhuǎn)座子的兩個轉(zhuǎn)座臂PiggyBacL和PiggyBacR，以及兩個轉(zhuǎn)座

3、臂之間的兩個表達(dá)框，一個功能表達(dá)框是A3啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因表達(dá)框，即A3 Promoter-EGFP-SV40，第二個包括絲素輕鏈基因啟動子或絲膠基因啟動子、絲素蛋白輕鏈基因信號肽、六聚組氨酸、腸激酶酶切位點和家蠶絲素蛋白輕鏈基因3'末端的表達(dá)框。DDDDK與絲素輕鏈基因polyA之間含有ApaⅠ和NheⅠ專一性的兩個酶切位點，用以切開質(zhì)粒，插入目的外源基因，形成完整的donor質(zhì)粒。本發(fā)明的質(zhì)粒能夠只經(jīng)一次酶切連接就完成表達(dá)

4、各種外源基因donor質(zhì)粒的構(gòu)建，減少了每次從頭構(gòu)建donor質(zhì)粒的工作量，提高家蠶中后部絲腺生物反應(yīng)器工作效率。
　　針對外源蛋白表達(dá)量低的問題，本研究通過在Serl promoter后增加18s rRNA啟動子，構(gòu)成雙啟動子表達(dá)外源蛋白的模式。通過熒光定量PCR和Western blot比較分析，我們發(fā)現(xiàn)含有雙啟動子的轉(zhuǎn)基因家蠶品種T4 Ligase基因的平均表達(dá)量SL的1.2倍，雙啟動子可以提高外源基因的表達(dá)。
　　不