用植物葉綠體為生物反應(yīng)器表達(dá)重要外源蛋白的研究.pdf

1、用植物為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源重組蛋白已成為生物技術(shù)研究的新領(lǐng)域。在植物中表達(dá)外源重組蛋白具有遺傳操作簡單、生產(chǎn)成本低、無動(dòng)物病毒和細(xì)菌毒素污染等優(yōu)點(diǎn)。近幾年發(fā)展起來的植物葉綠體轉(zhuǎn)化技術(shù)可使外源基因定向?qū)肴~綠體基因組中并實(shí)現(xiàn)表達(dá)。葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化與傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)化相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，如高效表達(dá)外源基因；通過同源重組定點(diǎn)整合方式導(dǎo)入外源基因消除了位置效應(yīng)及基因沉默；能同時(shí)進(jìn)行多基因表達(dá)；母系遺傳方式可防止外源基因通過花粉擴(kuò)散等。因此，利用植物葉綠體

2、為生物反應(yīng)器生產(chǎn)動(dòng)物口服疫苗、細(xì)胞生長因子及工農(nóng)業(yè)酶制劑成為生物工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是單細(xì)胞植物，素有“綠色酵母”(green yeast)之稱，其含有一個(gè)單一約占整個(gè)細(xì)胞體積40％的大型杯狀葉綠體，且與質(zhì)膜緊貼，使外源基因的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后的同質(zhì)化過程較為容易。因此，衣藻葉綠體是表達(dá)外源蛋白質(zhì)的理想材料。 TRAIL(tumor necrosis factor-relate

3、d apoptosis inducing ligand)，亦稱Apo-2L，是新發(fā)現(xiàn)的又一腫瘤壞死因子超家族成員，它能選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)正常細(xì)胞無毒性，這一特點(diǎn)顯示TRAIL是一種新的抗腫瘤藥物，在腫瘤治療中有著潛在的、廣泛應(yīng)用前景。我們選擇衣藻葉綠體基因組 clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2為同源重組片段，壯觀霉素抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記，構(gòu)建了編碼TRAIL胞外區(qū)可溶性片段(sTRAIL)的cDNA衣

4、藻葉綠體表達(dá)載體p64TRAIL，通過基因槍將其導(dǎo)入衣藻葉綠體中，經(jīng)壯觀霉素抗性篩選，獲得了3個(gè)抗性衣藻轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過抗性繼代篩選后，經(jīng)PCR、Southern blot檢測(cè)分析及暗培養(yǎng)，證實(shí)sTRAIL編碼區(qū)DNA整合到衣藻葉綠體基因組中，Westernblot檢測(cè)分析表明sTRAIL編碼區(qū)在衣藻葉綠體中獲得了表達(dá)。Western blot影像攝錄分析表明，表達(dá)的sTRAIL蛋白占衣藻細(xì)胞可溶性總蛋白的0.43％-0.67％。實(shí)驗(yàn)

5、結(jié)果證明用衣藻葉綠體為生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白是可行的。 來源于 Pyrococcus．furiosus的耐高溫α-淀粉酶是一種重要的酒精工業(yè)用酶，在植物中表達(dá)耐高溫α-淀粉酶可以大大降低用植物秸稈生產(chǎn)酒精的成本。 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了來源于Prococcus.furiosus的耐高溫α-淀粉酶基因的衣藻葉綠體表達(dá)載體p64A。通過基因槍將其導(dǎo)入衣藻葉綠體中，經(jīng)壯觀霉素抗性(100mg/L)篩選，獲得了9個(gè)抗性衣藻轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子

6、經(jīng)過抗性繼代篩選后，經(jīng)PCR、Southern blot檢測(cè)分析及暗培養(yǎng)，證明耐高溫α-淀粉酶基因整合到衣藻葉綠體基因組中并得到表達(dá)。酶活性檢測(cè)表明，轉(zhuǎn)基因衣藻表達(dá)產(chǎn)物具有耐高溫α-淀粉酶活性，最高達(dá)77.5U/g鮮重衣藻。用植物為生物反應(yīng)器生產(chǎn)動(dòng)物口服疫苗是一條安全、有效、廉價(jià)的動(dòng)物疫苗生產(chǎn)新途徑。營養(yǎng)豐富，適口性好的豆科牧草是表達(dá)植物性動(dòng)物食用疫苗的首選受體植物，表達(dá)的疫苗無須提取純化，可以直接食用免疫。口蹄疫(Foot and M

7、outh Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄目動(dòng)物強(qiáng)烈傳染病?？谔阋卟《颈砻嬷饕Ｗo(hù)性抗原基因VP1編碼的囊膜糖蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)動(dòng)物免受病毒侵襲。為了開辟生產(chǎn)口蹄疫疫苗的新途徑，我們構(gòu)建了兩種口蹄疫病毒主要保護(hù)性抗原基因VP1與強(qiáng)黏膜免疫佐劑霍亂毒素B亞基(CTB)的融合基因CTBVP1在優(yōu)良豆科牧草百脈根葉綠體基因組中定點(diǎn)整合表達(dá)載體。通過對(duì)百脈根葉綠體基因組的分析，選擇合適的外源基因在其中的

8、整合位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)引物用PCR 方法擴(kuò)增了兩對(duì)葉綠體基因組同源片段psbA、trnK和rbcL、atpB，構(gòu)建百脈根特異的葉綠體轉(zhuǎn)化通用載體pAK和pLB；選擇葉綠體基因特異的強(qiáng)啟動(dòng)子Prrn和終止子TpsbA為調(diào)控序列，構(gòu)建了包含CTBVP1融合基因表達(dá)盒和aadA壯觀霉素抗性基因表達(dá)盒的百脈根葉綠體定點(diǎn)整合載體pAKCV和pLBCV；經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證，所構(gòu)建的轉(zhuǎn)化載體符合預(yù)期設(shè)計(jì)。百脈根葉綠體轉(zhuǎn)化載體的合理構(gòu)建為百脈根葉綠體的轉(zhuǎn)化及