家蠶后部絲腺基因表達(dá)差異的分析與蠶絲性能改良的研究.pdf

1、家蠶是鱗翅目泌絲型經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，絲腺是合成分泌絲蛋白、決定蠶絲產(chǎn)量和質(zhì)量的重要組織器官。絲腺具有高效合成絲蛋白的能力，但采用家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)外源蛋白時(shí)，至今為止的所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證明外源蛋白的表達(dá)量很低，極大多數(shù)僅占繭絲蛋白含量的百分之幾。為了利用具有極強(qiáng)機(jī)械性能的黑寡婦蜘蛛牽引絲改良家蠶絲纖維的機(jī)械性能，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究了家蠶后部絲腺基因表達(dá)調(diào)控的特征，初步揭示了絲腺高效合成絲蛋白的分子機(jī)制，提供了利用絲腺高

2、效表達(dá)蜘蛛絲蛋白的方法和策略;本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)建了含有蜘蛛絲蛋白的家蠶品種，極大地改良了蠶絲的機(jī)械性能。具體取得的研究結(jié)果如下:
　　1.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了影響蠶絲蛋白合成的代謝通路
　　以秋豐、裸蛹(Nd)和絲膠繭(Nd-s)3個(gè)家蠶品種5齡第3天后部絲腺為材料，采用RNA-seq高通量測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組研究方法，結(jié)果表明Nd和Nd-s這2個(gè)低絲量的突變品種中，組成繭絲蛋白基因的表達(dá)水平下降，導(dǎo)致絲產(chǎn)量降低;與絲腺生長(zhǎng)發(fā)育

3、相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，阻礙了絲腺的發(fā)育，影響了絲蛋白的正常合成;絲腺組織中合成了大量不成熟的、錯(cuò)誤折疊的蛋白，造成蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)和抗氧化代謝等一系列耗能的代謝增加，大量的能量被空耗在用來(lái)維持細(xì)胞自身的穩(wěn)態(tài)上面，最終影響了絲蛋白的合成代謝。
　　2.蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了影響蠶絲蛋白合成的代謝通路
　　采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析相同的實(shí)驗(yàn)材料，用同位素標(biāo)記定量法(Isobaric tags forrelative and absolute

4、 quantitation，iTRAQ)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析得知，Nd和Nd-s這2個(gè)低絲量的突變品種的繭絲關(guān)鍵蛋白表達(dá)量下降，絲腺發(fā)育相關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào)，絲蛋白合成及信號(hào)通路相關(guān)的蛋白表達(dá)下調(diào)，絲蛋白的分泌及運(yùn)輸途徑相關(guān)的蛋白也受到影響，大量的能量被空耗到無(wú)效的代謝途徑上，最終影響了絲蛋白的高效合成。
　　3.采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良了家蠶繭絲的機(jī)械性能
　　以piggyBac載體為基礎(chǔ)，根據(jù)黑寡婦蜘蛛牽引絲蛋白設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建

5、了包含不同重復(fù)單元的類(lèi)MaSp1和MaSp2的系列載體，利用顯微注射的方法，將其整合到家蠶的基因組內(nèi)，經(jīng)Inverse-PCR、Q-PCR、Western blotting等方法的檢測(cè)，證明已成功獲得了16個(gè)轉(zhuǎn)蜘蛛絲基因家蠶品系。這些品系的繭絲的機(jī)械性能顯著提高，與野生型對(duì)照品種相比，最大應(yīng)力最高提高71.92％，最大應(yīng)變提高34.508％，楊氏模量提高57.819％，韌性最高提高131.673％。
　　4.證明了羆寡婦蜘蛛牽引絲

6、的機(jī)械性能與其蛋白分子量大小成極顯著的線(xiàn)性關(guān)系
　　采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了類(lèi)黑寡婦蜘蛛Black Widow Spider，Latrodectushesperus牽引絲MaSp1基因不同長(zhǎng)度的分子的轉(zhuǎn)基因蜘蛛絲家蠶，根據(jù)多個(gè)轉(zhuǎn)基因家系以及雜合型和純化型2種基因型對(duì)比研究結(jié)果，都證明了分子越長(zhǎng)絲的機(jī)械性能越好，說(shuō)明黑寡婦蜘蛛牽引絲的超級(jí)性能來(lái)源于她的分子長(zhǎng)度，暗示了自然界機(jī)械性能優(yōu)良的蛋白性絲纖維都采用高度重復(fù)的大分子蛋白的策略是生物

7、進(jìn)化的一種必然結(jié)果。
　　綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)秋豐、裸蛹(Nd)和絲膠繭(Nd-s)3個(gè)家蠶品種的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組差異表達(dá)譜分析，揭示了絲蛋白高效合成的機(jī)制，為改良家蠶絲腺特性，作為生物反應(yīng)器高效地合成外源蛋白奠定了分子基礎(chǔ)。本研究采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了轉(zhuǎn)蜘蛛絲基因家蠶品種，顯著提高了家蠶繭絲的機(jī)械性能，并證明了絲纖維的機(jī)械性能與組成其蛋白分子量之間呈極顯著的線(xiàn)性關(guān)系，為進(jìn)一步改良蠶絲質(zhì)量奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果揭示了如果能夠