不同食性家蠶品種(品系)3個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)特征分析.pdf

1、家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲,用人工飼料養(yǎng)蠶是今后養(yǎng)蠶業(yè)發(fā)展的方向,但目前我國(guó)飼養(yǎng)的蠶品種對(duì)人工飼料的攝食性多數(shù)達(dá)不到實(shí)用化要求,成為制約該技術(shù)推廣的主要障礙,提高家蠶對(duì)人工飼料的攝食性和適應(yīng)性是一項(xiàng)重要的研究課題。前人已經(jīng)從通遺傳學(xué)角度對(duì)食性遺傳模式進(jìn)行了很多研究,但在分子生物學(xué)水平上食性差異的機(jī)理尚不清楚,目前尚未發(fā)現(xiàn)所謂的“食性基因”。
　　本研究室利用人工飼料育系統(tǒng)選擇方法,經(jīng)過連續(xù)多代選擇,選育出對(duì)人工飼料攝食性存在很大差異

2、的家蠶品種、品系,并構(gòu)建了不同攝食性蠶品種Long-SAGE文庫(kù)。本研究從不同攝食性家蠶SAGE文庫(kù)數(shù)據(jù)分析入手,發(fā)掘了一條家蠶假定表皮蛋白基因BmCph2(cuticular protein hypothetical 2)和兩條家蠶多藥耐藥蛋白基因BmMrp1(Multidrug resistance-associated protein 1)和BmMrp2(Multidrug resistance-associated protei

3、n 2)。采用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,對(duì)以上3個(gè)基因在不同食性蠶品種和品系中的表達(dá)特征進(jìn)行了研究。主要獲得如下結(jié)果:
　　1.對(duì)BmCph2基因進(jìn)行染色體定位及基因結(jié)構(gòu)分析表達(dá),該基因位于家蠶2號(hào)染色體的nscaf2964,具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。BmCph2全長(zhǎng)770bp,最大開放閱讀框648bp,編碼216個(gè)氨基酸。RT-PCR檢測(cè)5齡3日BmCph2基因的組織表達(dá)特異性顯示,該基因在幼蟲頭部,體壁及中

4、腸中高表達(dá),其次為精巢和絲腺,在卵巢、脂肪體和血液中表達(dá)量較低。
　　2.以廣食和魯七的全蠶、頭部及消化管為材料,分別測(cè)定BmCph2基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)活性。結(jié)果表明,全蠶中該基因在胚胎期和各齡將眠期表達(dá)活性很低,在眠期和起蠶時(shí)高表達(dá),頭部與全蠶的表達(dá)特征基本一致,但在中腸中表達(dá)活性較低,而且表達(dá)時(shí)間比全蠶和頭部提前,因此推測(cè),該基因的表達(dá)可能與家蠶新表皮的形成有關(guān)。另外,BmCph2基因在不同食性蠶品種中的表達(dá)活性存在差異

5、,其中在全蠶和頭部中幾個(gè)高表達(dá)期,均是對(duì)人工飼料攝食性差的魯七品種中顯著高于攝食性好的廣食品種,而在中腸中的表達(dá)活性則是廣食高于魯七。
　　3.以對(duì)人工飼料攝食性好的廣食(3齡起蠶)、菁松A、B高食系(2齡起蠶)及攝食性差的魯七(3齡起蠶)和菁松A、B低食系(2齡起蠶)為材料,分別用桑葉、人工飼料、薄荷油、樟腦丸進(jìn)行氣味刺激或取食刺激15-60min,然后檢測(cè)全蠶中BmCph2基因表達(dá)活性的變化。結(jié)果表明,高食性蠶總體上對(duì)刺激的反

6、應(yīng)比較敏感,多數(shù)處理后基因表達(dá)下調(diào),會(huì)在少數(shù)處理后表達(dá)上調(diào)或無(wú)顯著影響,但氣味和取食刺激對(duì)低食性蠶BmCph2基因表達(dá)影響較小,除魯七品種部分處理后表達(dá)下調(diào)外,多數(shù)處理后與對(duì)照不存在顯著差異,尤其是菁松A、B低食系幾乎不受影響。本試驗(yàn)結(jié)果說明,BmCph2基因除參與表皮形成之外,還與家蠶的食性有密切關(guān)系,其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　4.對(duì)BmMrp1和BmMrp2進(jìn)行基因定位和結(jié)構(gòu)分析表明,兩個(gè)基因均定位于15號(hào)染色體的nsc

7、af2887,cDNA長(zhǎng)度分別為5170bp和4345bp,最大ORF序列相同,均為3807bp,且均含有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子,具有很大的同源性,特別是中間部分的序列幾乎完全相同,只有在兩基因的首尾存在差異。利用RT-PCR檢測(cè)大造品種5齡3日家蠶幼蟲不同組織中兩基因的表達(dá)活性,結(jié)果顯示,BmMrp1&2在中腸和精巢中高表達(dá),其次為卵巢和絲腺,在其他組織中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。
　　5.以對(duì)人工飼料攝食性不同的蠶品種、品系為材料

8、,測(cè)定不同齡期BmMrp1和2兩基因的共同表達(dá)即各自的表達(dá)情況。結(jié)果表明,在3齡起蠶BmMrp1&2的共表達(dá)及各自的表達(dá)活性,均是高食性的廣食品種顯著低于低食性的魯七,在2齡起蠶,不同食性品系菁松A的BmMrp1、不同食性品系菁松B的BmMrp1&2共表達(dá)以及BmMrp2的表達(dá)活性也是高食性品系低于低食性品系,而在2齡起蠶,不同食性菁松A的BmMrp1&2的共表達(dá)及BmMrp2的表達(dá),菁松B不同品系BmMrp1的表達(dá),以及蟻蠶期菁松A和

9、菁松B不同品系,BmMrp1&2的共表達(dá)活性,均是高食性品系高于低食性品系;廣食和魯七的蟻蠶期兩基因的表達(dá)無(wú)顯著性差異?？梢夿mMrp1和BmMrp2基因在不同食性蠶體中的表達(dá)沒有統(tǒng)一規(guī)律性。
　　6.飼料氣味、取食刺激及忌避劑刺激對(duì)BmMrp1&2的共表達(dá)及各自的表達(dá)活性均有顯著影響,即存在誘導(dǎo)表達(dá)現(xiàn)象,但對(duì)不同食性的品種、品系及同一品系不同發(fā)育階段的影響是不同的。從總體統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看,桑葉氣味和取食桑葉刺激對(duì)該基因表達(dá)的影響存在

10、大致相似的趨勢(shì):對(duì)高食性蠶(品種和品系)這兩個(gè)基因的共表達(dá)以下調(diào)為主,而對(duì)低食性蠶則以上調(diào)居多。但對(duì)其中一個(gè)基因的誘導(dǎo)表達(dá)與兩基因的共表達(dá)不同,而且無(wú)統(tǒng)一規(guī)律性。人工飼料氣味和取食飼料刺激對(duì)該基因的表達(dá)也存在相似的影響,無(wú)論是對(duì)高食性蠶還是低食性蠶,這兩個(gè)基因的共表達(dá)均以上調(diào)為主,而對(duì)其中一個(gè)基因表達(dá)的影響則以下調(diào)為主。忌避劑薄荷油和樟腦的氣味刺激對(duì)BmMrp1&2的表達(dá)也有不同程度的影響,但薄荷油的影響總體上比樟腦的影響小,而且未發(fā)現(xiàn)