家蠶醛氧化酶基因的鑒定與表達特征分析.pdf

1、隨著后基因組時代的來臨，家蠶作為鱗翅目模式昆蟲已漸漸成為基因功能研究的理想遺傳資源。目前，家蠶基因組精細圖的完成更是為家蠶功能基因組研究提供了豐富的信息。醛氧化酶(AO，EC1.2.3.1)是一類能催化醛類氧化成羧酸并釋放出活性氧的蛋白酶，它屬于鉬-黃素酶(MFE)家族，具有該家族保守的功能域。AO廣泛地存在于動植物體內(nèi)，是有著眾多生理生化功能的重要酶類。它屬丁多基因家族，不同的AO亞型執(zhí)行著不同的生理功能。已有的研究表明，它在植物中參

2、與催化吲哚乙酸與脫落酸的生物合成反應；在哺乳動物中，參與代謝產(chǎn)物和外源物的氧化降解、視黃酸合成、藥物代謝及肝臟中有毒化合物代謝，還與一些人類疾病的病理相關(guān)，其活性水平已成為醫(yī)學上臨床用藥及治療效果評估的一個重要參數(shù)；另外，AO在昆蟲嗅覺的氣味分子降解過程中也起著至關(guān)重要的作用，且與昆蟲抗藥性相關(guān)。但是，作為一種重要的代謝酶類，醛氧化酶在遺傳、進化及生理生化功能等方面的信息還相當匱乏。本研究利用家蠶全基因組數(shù)據(jù)，對家蠶醛氧化酶基因(BmA

3、OX)家族進行了鑒定和生物信息學分析，采用RT-PCR、基因克隆、Native-PAGE、組織原位雜交等技術(shù)對BmAOX的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達特征進行了分析，同時對其中兩個組織特異表達的BmAOX家族成員作了功能初探。主要研究結(jié)果如下： 1.家蠶醛氧化酶基因(BmAOX)的鑒定及生物信息學分析 基于序列的相似性及功能域的保守性，我們在家蠶基因組中對醛氧化酶基因家族作了生物信息學分析，成功找到了8個BmAOX候選

4、基因，分別命名為BmAOX1，BmAOX2，BmAOX3、BmAOX4、BmAOX5，BmAOX6，BmAOX7、BmAOX8。它們位于家蠶第18號染色體上，預測序列含12～20個外顯子，編碼閱讀框長3201～3831bp，預測蛋白含1073～1276個氨基酸殘基，分子量大小為118.5～141.8kDa，等電點為5.18～7.57。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這8個BmAOX均具有醛氧化酶保守的功能域。進化分析表明，它們與昆蟲AO基因聚為一簇。

5、 2.BmAOX在轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的表達特征 通過RT-PCR和組織蛋白Native-PAGE的AO活性染色方法，對已鑒定出來的8個家蠶醛氧化酶候選基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達特征做了分析。結(jié)果顯示：BmAOX1，BmAOX2僅在蠶蛾觸角中表達，BmAOX3僅在蠶蛹生殖腺表達，BmAOX5僅在雌蛾的性信息腺表達，這四個基因具有很強的組織特異性。其中BmAOX1、BmAOX2的表達特征與已有的報道一致；BmAOX6在蛹

6、中不表達，而在蛾的觸角、胸、腹、翅等多個組織均有表達，具有時期特異性。另外，BmAOX4，BmAOX7，BmAOX8在蛹和蛾的多個組織均有表達，說明它們在家蠶生理代謝活動中起著重要的作用。在蛋白水平上，我們檢測劍家蠶蛹中有5種有活性的酫氧化酶，而蠶蛾中有6種，各組織中均有有活性的BmAOX，只是種類和活性有所不同。 3.生殖腺特異表達的BmAOX3的克隆及表達特征分析 對家蠶生殖腺特異表達的BmAOX3基<進行了編碼序列

7、的克隆，獲得了全長為3537bp的完整ORF，編碼的蛋白含1178個氨基酸，分子量大小為132.7kDa，等電點為8.06。BmAOX3的多序列比對結(jié)果顯示，它具有醛氧化酶高度保守區(qū)域，進一步證明了它屬于鉬黃素酶家族的醛氧化酶亞家族。BmAOX3在5齡末期和蛹末期的卵巢中高量表達，且隨家蠶發(fā)育時期呈周期性變化，到蛾期停止表達。而不同時期卵巢的醛氧化酶蛋白活性檢測結(jié)果顯示：以蛹3天為界，在此之后的卵巢中，醛氧化酶不論從活性還是種類上均人人

8、增加。初步推測：在這個卵巢處丁新陳代謝旺盛的發(fā)育階段，BmAOX3可能參與其中某一個或幾個生理代謝途徑，從而在卵巢的發(fā)育及卵的形成過程中起作用。 4.性信息腺特異表達的BmAOX5的克隆及表達特征分析 本研究克隆了雌蛾性信息腺特異表達的BmAOX5的編碼序列，獲得的完整ORF全長為3737bp，編碼含1245個氨基酸的蛋白，分子量大小為137.9kDa，等電點為5.54。通過氨基酸序列的多序列比對，證實BmAOX5具有作

9、為醛氧化酶家族成員所特有的高度保守的功能域。對不同時期雌蛾性信息腺作BmAOX5的時期表達譜，發(fā)現(xiàn)該基因在蛾繁殖時期有高量表達。同樣在蛋白活性檢測中也發(fā)現(xiàn)了明顯的醛氧化酶活性帶。以BmAOX5 RNA為探針進行組織原位雜交，結(jié)果顯示該基因在性信息腺囊壁和產(chǎn)卵管內(nèi)壁表達。推測BmAOX5與降解性信息素、調(diào)節(jié)性信息素濃度有關(guān)；同時該基<可能還參與一般環(huán)境氣味分子的代謝，在家蠶生殖活動和產(chǎn)卵場所的選擇中起重要作用。 綜上所述，本研究基

10、于家蠶全基因組數(shù)據(jù)，對家蠶醛氧化酶基<家族進行了較為完整的鑒定分析，找到了8個BmAOX候選基因。從這8個BmAOX在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達特征看，其中多個基<都在各組織有表達，說明它們在家蠶生理代謝活動中起著重要的作用。同時找到了在生殖腺特異表達的BmAOX3和在雌性信息腺特異表達的BmAOX5。通過分析BmAOX3的序列及表達特征，初步認為BmAOX3可能參與卵巢的發(fā)育及卵的形成。通過BmAOX5的克隆、時期表達譜及組織定位分析，