番茄GA20-氧化酶和GA2-氧化酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、赤霉素(GA)是一類重要的植物激素，具生物活性的 GA 作用于高等植物的整個生命周期。包括種子萌發(fā)、莖和根的伸長、葉片伸展、表皮毛發(fā)育、花粉管伸長、花和果實的發(fā)育等。而且植物也通過調(diào)節(jié)內(nèi)源赤霉素的生物合成來介導自身對環(huán)境因子的應答。因此，赤霉素生物合成的調(diào)控對植物的發(fā)育及其對環(huán)境的適應有著極為重要的意義。以前在農(nóng)業(yè)或園藝學上對植株的調(diào)控主要是采用一些化學的方法。在了解了GA生物合成途徑的基礎上就可以利用生物技術(shù)從基因水平上對植株特定組織

2、的特定基因進行調(diào)控來控制植株的生長。 目前赤霉素生物合成途徑中大部分的關(guān)鍵酶基因已經(jīng)被克隆，這些基因的克隆為我們探討 GA 在植物根、莖、葉、花和果實的發(fā)育過程中的作用機理創(chuàng)造了條件。GA 20-氧化酶和GA 2-氧化酶是赤霉素合成代謝途徑中的兩個關(guān)鍵酶，都由多基因家族編碼，GA 20-氧化酶促進活性GA的合成而GA 2-氧化酶將活性的GA轉(zhuǎn)化為非活性GA。對GA 20-氧化酶和GA 2-氧化酶基因的表達進行調(diào)控，將影響活性GA

3、的合成代謝，從而影響植物的生長發(fā)育。目前，番茄的GA 2-氧化酶基因還沒有被克隆。對 GA 20-氧化酶基因家族各個成員分別在植物生長發(fā)育中的功能的研究也沒有報道。番茄是研究植物生長發(fā)育比較好的模式植物，以番茄為材料研究GA2-oxidase和GA 20-oxidase基因家族不同成員的生物學功能，對全面了解赤霉素在植物根、莖、葉、花、果等的生長、發(fā)育以及形態(tài)建成過程中所發(fā)揮的作用，闡明其作用的可能的分子機理有著重要的理論意義。同時對番

4、茄生產(chǎn)中合理利用赤霉素來調(diào)控番茄植株的生長發(fā)育也具有實際的指導意義。 本研究以番茄這一重要的蔬菜作物為材料，克隆了編碼番茄 GA20-氧化酶的 3個家族成員，利用RNA干涉技術(shù)分別調(diào)控3個基因的表達，從分子水平，植株表型以及組織顯微結(jié)構(gòu)、生理生化指標測定等方面進行分析，初步確定了3個GA 20-氧化酶在植物生長發(fā)育過程中的主要功能；克隆和鑒定番茄GA 2-oxidase2全長基因，分析了其序列特征。構(gòu)建了干涉表達載體，從分子水平

5、進行分析闡明了該基因可能的作用機理。本研究獲得的主要結(jié)果如下： 1.克隆了番茄赤霉素生物合成途徑中的GA 2-氧化酶2(GA2ox2)基因的全長cDNA。其GenBank登錄號為EF017805，測序結(jié)果表明該cDNA全長1203 bp，包含一個長為969 bp的完整開放讀碼框，編碼322個氨基酸。 2.對3個GA 20-oxidase和GA 2-oxidase2基因在番茄不同組織器官中的表達進行了半定量 RT-PCR

6、分析，結(jié)果表明這兩個基因在番茄根、莖、葉、花、果實等各種組織器官中呈組成型表達，但不同組織的表達水平有差異。 3.構(gòu)建了GA 20-oxidasc和GA 2-oxidase2基因的RNAi表達載體共4個。利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化方法將 RNAi 表達載體導入常規(guī)番茄品種中蔬五號中，共獲得卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化植株85棵。PCR檢測和Southern雜交結(jié)果表明，外源基因已經(jīng)整合到番茄基因組中，其拷貝數(shù)1-6個不等。 4.對RN

7、Ai轉(zhuǎn)基因植株中目標基因的表達量進行半定量RT-PCR分析。結(jié)果顯示，靶基因在相應RNAi轉(zhuǎn)基因植株不同組織器官中的表達量有不同程度的降低，單個GA 20-oxidase基因家族成員的表達受抑制時其它成員的表達不受影響。說明RNAi能特異有效的抑制目標基因的表達。 5.采用 ELISA 對 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株的赤霉素含量進行了測定，結(jié)果表明：抑制GA20ox1和 GA20ox2基因的表達顯著降低植物體內(nèi) GA的合成；抑制GA2

8、0ox3基因的表達對GA的合成影響較小。GA 2-oxidase2基因的抑制對植物GA的合成沒有影響。 6.對轉(zhuǎn)基因植株進行了表型的觀測和相關(guān)形態(tài)指標以及生理指標的測定。結(jié)果表明：GA20ox1和GA20ox2 RNAi轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)半矮化，葉片變小增厚，葉色加深；葉綠素含量增加，光合效率增強。GA20ox3 RNAi轉(zhuǎn)基因植株側(cè)根數(shù)量減少，長度略增加。3個GA20ox的 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株均能正常開花結(jié)果，形成正常的種子。說

9、明抑制 GA20ox的表達對植物營養(yǎng)器官的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，而對生殖器官的發(fā)育影響不大。 7.有些植物赤霉素嚴謹型突變體種子敗育，種子發(fā)芽率降低。對3個GA 20-oxidaseRNAi轉(zhuǎn)基因植株的種子進行了發(fā)芽實驗。結(jié)果表明，抑制GA20ox的表達影響種子萌發(fā)，種子萌發(fā)率降低，萌發(fā)時間推遲。 8.轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)半矮化，葉片變小增厚。莖和葉的組織顯微結(jié)構(gòu)顯示：GA20ox1和GA20ox2 RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片葉肉細胞

10、增大，柵欄組織發(fā)達，排列緊密，葉厚度顯著增加；莖的木質(zhì)部厚度減小。GA20ox3 RNAi轉(zhuǎn)基因植株莖和葉的顯微結(jié)構(gòu)與對照相似。說明GA20ox1、GA20ox2的抑制表達影響了莖和葉中不同組織細胞的分裂和形成，GA20ox3的抑制對莖、葉細胞結(jié)構(gòu)影響不大。 9.植株矮化，葉片增厚是植物抗逆性提高的兩個表觀特征。對GA20-oxidase RNAi轉(zhuǎn)基因植株后代的抗旱特性進行了初步觀測，結(jié)果表明抑制GA20ox1和GA20ox2