番茄ACC氧化酶家族基因的表達研究及其在果實乙烯合成過程中的功能分析.pdf

1、植物果實的成熟是一個復(fù)雜卻又受嚴格調(diào)控的過程。番茄果實是一種典型的呼吸躍變型果實，是人類飲食的重要組成部分；同時，番茄因為具有較小的基因組、轉(zhuǎn)基因技術(shù)成熟、突變體眾多等特點，成為了研究果實成熟及乙烯作用機理的模式品種。以往研究表明，番茄果實同時具有系統(tǒng)Ⅰ的持續(xù)低水平的乙烯合成和系統(tǒng)Ⅱ的在呼吸躍變期高水平的乙烯合成。而乙烯作為一種重要的植物激素，在番茄果實的發(fā)育成熟過程中起著關(guān)鍵性作用。植物內(nèi)源乙烯的合成途徑早已闡明，ACC合成酶(ACS

2、)及ACC氧化酶(ACO)被認為是控制植物內(nèi)源乙烯合成的關(guān)鍵酶。迄今為止，對于ACS的研究開展較早，也較為詳細；而對于ACO基因家族的研究則相對較少。已報道的ACO基因家族成員有5個(LeACO1-5)，其中LeACO1-4基因已經(jīng)被較為詳細地研究。而對于LeACO5基因的表達模式及其在乙烯合成中起的作用仍然未知，本文旨在闡明番茄ACO基因家族各成員分別在果實的乙烯合成系統(tǒng)Ⅰ、轉(zhuǎn)變期和系統(tǒng)Ⅱ中的哪些階段發(fā)揮作用，為從分子水平調(diào)控番茄果實

3、成熟，延長其貯藏期提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1.番茄ACO基因家族的克隆
　　 通過GenBank查詢到已知的5個番茄ACO基因家族成員序列，同時通過序列比對從TIGR數(shù)據(jù)庫中篩選了一個新的番茄ACO基因家族成員并命名為LeACO6，設(shè)計特異性引物，采用RT-PCR的方法從番茄中獲得了LeACO1-6基因的克隆片段。
　　 2.番茄ACO基因家族序列比對
　　 經(jīng)分析，LeACO6基因

4、mRNA序列全長1293bp，包含960bp的開放閱讀框序列，編碼319個氨基酸，所編碼的氨基酸與LeACO1-5的同源性分別為79.6％，76.6％，78.1％，85.6％和45.3％。將LeACO6推演出的氨基酸序列與其他家族成員進行比對后繪制出了番茄ACO基因家族進化樹。LeACO6基因與LeACO4基因的同源性最高，LeACO5基因與其他家族成員的進化關(guān)系最遠。
　　 3.半定量分析LeACO1-6基因在野生型番茄果實的

5、表達模式
　　 研究了LeACO1-6基因在野生型番茄果實發(fā)育的五個階段immature green(IMG)，mature green(MG)，breaker(B)，breaker+4day(B+4)，breadker+7day(B+7)的表達模式，結(jié)果證實了LeACO1基因會同時參與果實系統(tǒng)Ⅰ至系統(tǒng)Ⅱ的乙烯合成作用；LeACO3基因主要參與從系統(tǒng)Ⅰ過渡至系統(tǒng)Ⅱ的轉(zhuǎn)變期(transitionstage)的乙烯合成，而LeACO

6、5和LeACO6基因均參與果實發(fā)育前期系統(tǒng)Ⅰ的乙烯合成，此外，LeACO6基因還負責(zé)轉(zhuǎn)變期的乙烯合成，與其他在轉(zhuǎn)變期大量表達的基因一起提高果實內(nèi)源性乙烯的產(chǎn)量，啟動系統(tǒng)Ⅱ的乙烯合成。
　　 4.半定量研究乙烯處理與葉傷害處理對番茄ACO家族成員表達的影響
　　 采用半定量研究了MG時期果實在乙烯處理8h后及葉片傷害處理1-4h后ACO基因家族成員表達水平的變化。結(jié)果表明LeACO1、LeACO3和LeACO6基因在MG時

7、期果實的表達會受到外源乙烯的誘導(dǎo)，而LeACO4基因的表達水平則會被抑制。這表明LeACO1、LeACO3和LeACO6基因可能會先于LeACO4負責(zé)轉(zhuǎn)變期的乙烯合成。LeACO5基因的表達與外源乙烯沒有明顯的聯(lián)系。葉傷害處理實驗表明LeACO1、LeACO3和LeACO4基因可能與葉片的傷害應(yīng)急反應(yīng)有關(guān)。
　　 5.定量分析LeACO5和LeACO6基因在果實中的表達模式
　　 采用熒光實時定量PCR研究了LeACO5

8、和LeACO6基因在野生型番茄果實、rin和Nr突變體果實不同發(fā)育時期的表達模式。LeACO5和LeACO6基因在野生型果實中的表達模式與半定量的結(jié)果比較接近；LeACO5和LeACO6基因均在rin突變體果實中持續(xù)表達但表達模式與野生型相比有顯著差異；LeACO5基因在Nr突變體果實中具有“延遲表達”的現(xiàn)象，而LeACO6的高水平表達一部分依賴于果實對于乙烯的敏感性。這些結(jié)果表明：LeACO5和LeACO6基因均參與番茄果實系統(tǒng)Ⅰ的乙