ACC氧化酶基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)白姜花愈傷組織的轉(zhuǎn)化.pdf

1、花卉產(chǎn)業(yè)已成為世界上最具活力的產(chǎn)業(yè)之一。人們通過(guò)常規(guī)雜交育種、輻射育種、組織培養(yǎng)育種、多倍體育種、航天育種等手段培育了大量的花卉新品種。尤其是二十世紀(jì)九十年代以來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新品種成為育種工作者研究的熱點(diǎn)。將目的基因定向?qū)胫参锛?xì)胞或組織中，培育成植株，則可獲得人們預(yù)期的新品種，從而為花卉的定向育種提供了一條更有效的新途徑。 白姜花(Hedychium coronarium)為姜科姜花

2、屬一種多年生草本植物。其花色潔白、花型美麗、花香宜人，極具觀賞價(jià)值，深受消費(fèi)者青睞，在我國(guó)南方廣泛栽培并主要用作香型切花、庭院綠化和園林景觀植物。然而，白姜花切花的瓶插壽命較之其他切花短，一般只有2-3天。研究已表明，乙烯在白姜花衰老過(guò)程中可能起著重要作用。因此控制切花開放過(guò)程中乙烯的產(chǎn)量是延遲衰老的有效途徑之一。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入乙烯合成相關(guān)反義基因或利用RNAi技術(shù)，抑制白姜花切花的乙烯合成，將是獲得花期延長(zhǎng)的白姜花新

3、品種的非常值得探索的育種途徑。 本論文旨在已建立白姜花再生體系的基礎(chǔ)上，利用苜蓿ACC氧化酶基因片段，構(gòu)建ACC氧化酶基因反義表達(dá)載體，優(yōu)化影響該基因農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的主要因素，以期將反義ACO基因?qū)氲桨捉ㄖ校@得花期延長(zhǎng)的白姜花花新材料。主要研究結(jié)果如下： 1.優(yōu)化了白姜花花絲愈傷組織繼代培養(yǎng)基，研究了2,4-D對(duì)白姜花花絲愈傷組織生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2，4-D濃度為2.0mg/L的花絲繼代培養(yǎng)基中，愈

4、傷組織增殖速度最快，同時(shí)，在一定程度上也減少了愈傷組織的褐變，利于繼代培養(yǎng)。合適的白姜花花絲愈傷組織繼代培養(yǎng)基成分為：MS+6-BA(1.0 mg/L)+2,4-D(2.0 mg/L)+NAA(4.0 mg/L)。 2.從實(shí)驗(yàn)室保存得苜蓿葉片ACC氧化酶基因片段中亞克隆了814bp的片段，構(gòu)建了ACC氧化酶基因片段反義表達(dá)載體：將苜蓿ACC氧化酶基因該片段反向插入帶有XbaI和BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的pMD20-T Vector

5、(TaKaRa)上，得到ACO-T質(zhì)粒；用Xba Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切ACO-T質(zhì)粒和pBI121質(zhì)粒；電泳后分別回收800bp小片段和14kb大片段，二者連接克隆到E.coli DH5α中擴(kuò)繁：提取質(zhì)粒對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證并測(cè)序，證實(shí)反義ACO基因已插入pBⅠ121多克隆位點(diǎn)。將此質(zhì)粒稱為pBⅠ121-Alf-ACO。該質(zhì)粒載體含在35S啟動(dòng)子調(diào)控下的ACO基因、GUS基因和nptⅡ基因。然后通過(guò)凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。

6、 3.建立了白姜花花絲愈傷組織為受體的轉(zhuǎn)化體系：首先研究了花絲愈傷組織的cef脫農(nóng)桿菌的濃度、卡那霉素(KM)篩選濃度以及影響轉(zhuǎn)化頻率的因素。確定白姜花愈傷組織的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系：愈傷組織繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA(1.0 mg/L)+2，4-D(2.0 mg/L)+NAA(4.0 mg/L)。根癌農(nóng)桿菌離心后懸浮于愈傷組織繼代液體培養(yǎng)基中作為農(nóng)桿菌工程菌液?；ńz愈傷組織在OD<,600>=0.2的根癌農(nóng)桿菌菌液中浸染3

7、0min后，在花絲愈傷組織分化培養(yǎng)基(DM-F：MS+0.1 mg/LTDZ+0.2 mg/L NAA)上共培養(yǎng)3-4d；以500mg/L Cef為脫菌濃度，含75ml/L KM的DM.F培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織抗性篩選。 4. GUS基因表達(dá)的組織化學(xué)染色表明，擬轉(zhuǎn)化愈傷組織出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)，說(shuō)明GUS基因在該組織中得以表達(dá)。由于在pBl121-Alf-ACO載體上ACC氧化酶反義基因和GUS基因是順序串聯(lián)排列，因此初步判定ACC氧化