大豆脂肪氧化酶基因RNAi種子特異表達載體的構(gòu)建.pdf

1、大豆是既是我國主要的糧食作物，又是主要的油料作物，具有極高的營養(yǎng)價值，是人類食物和動物養(yǎng)殖的主要植物蛋白來源。但是，大豆含有凝集素、脂氧化酶、胰蛋白酶抑制劑等營養(yǎng)抑制因子影響大豆品質(zhì)。 大豆脂肪氧化酶是大豆主要營養(yǎng)抑制因子之一。脂肪氧化酶(Lipoxygenase.簡稱Lox)是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，專一催化具有順.順1，4戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸加氧反應(yīng)，生成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物，再經(jīng)裂解酶分解生成短碳鏈的醇

2、、酮和醛類等揮發(fā)性物質(zhì)，這些揮發(fā)性物質(zhì)導(dǎo)致大豆及其制品產(chǎn)生豆腥昧，這其中最主要的腥味物質(zhì)就是己醛和己醇。是影響大豆品質(zhì)的主要原因之一。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是直接有效的人為控制基因表達的方法，可以封閉特定基因的表達，引起基因轉(zhuǎn)錄后沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。所以，RNAi技術(shù)，在改良植物品質(zhì)方面有極大的應(yīng)用價值。 種

3、子特異型啟動子可以控制外源基因在植物種子中高效表達，避免外源基因在植物的其它部位表達，減少對植物的不利影響。利用種子特異型啟動子控制外源基因在種子中特異表達具有重要理論和實踐意義。 本項研究應(yīng)用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因，同時采用種子特異型啟動子構(gòu)建RNAi表達載體。以期抑制大豆脂肪氧化酶基因的表達，最終降低脂肪氧化酶的含量。同時提高蛋白或油份含量，為大豆品質(zhì)改良探索新途徑。本研究取得如下 結(jié)果： 1

4、.以大豆品種“吉農(nóng)18”總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，依據(jù)GenBanK中大豆脂肪氧化酶基因序列，克隆了大豆三種脂肪氧化酶基因(Lox1、Lox2、Lox3)中同源性最高部分357bp外顯子片段，通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增得到大豆脂肪氧化酶序列的保守序列，測序結(jié)果表明，該片段大小為357bp。將擴增的目的片段插入pMD18-T Vector克隆載體獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化后進行藍白斑篩選，取陽性菌落的質(zhì)粒進行PC

5、R檢測和酶切鑒定結(jié)果所得片段大小和目的片段一致。 2.將重組質(zhì)粒和植物表達載體pCAMBIA1301經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切，通過T4 DNA連接酶，將大豆種子特異型啟動子(本實驗室張宇構(gòu)建的帶有種子特異型啟動子的表達載體)、大豆脂肪氧化酶基因反義+正義片段、內(nèi)含子片段插入到pCAMBIA1301中相應(yīng)的多克隆位點中，構(gòu)建RNAi表達載體pCAMBIA1301-LoxiRt。將該RNAi表達載體pCAMBIA1301-LoxiRt轉(zhuǎn)