郁金香ACC氧化酶基因RNAi載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化的初步研究.pdf

1、郁金香(Tulipa gesneriana L.)是世界著名切花之一,也廣泛應用于花壇、庭院和室內(nèi)綠化中,深受各國人民的喜愛。但是郁金香花期不長,延長其花期對延長觀賞期和調(diào)節(jié)流通有重要作用。如何延長花朵的壽命已成為近年來專家們研究的主要課題之一。本研究通過克隆郁金香ACC氧化酶(ACO)基因片段,將其構(gòu)建成帶內(nèi)含子的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNAi植物表達載體,以求引起郁金香.ACC氧化酶基因的沉默,通過這種調(diào)控郁金香中乙烯表達的方法來控制花朵的衰老

2、,從而延長郁金香的花期,并建立起RNAi技術(shù)平臺。主要進行以下三個方面的研究:
　　 1、ACO基因片段的克隆及其植物RNAi表達載體的構(gòu)建
　　 根據(jù)郁金香ACO基因序列,設(shè)計一對特異引物,以郁金香品種‘Los Angeles’的花瓣cDNA為模板,擴增出郁金香ACO基因片段,將其連接到Pucm-T載體上,對序列測定結(jié)果進行分析顯示ACO基因片段克隆成功。將ACO基因片段切下先后通過反向和正向分別連接到中間載體pBSi

3、n的內(nèi)含子兩端,構(gòu)成了ACO基因的帶內(nèi)含子的發(fā)卡結(jié)構(gòu)(ihp結(jié)構(gòu))；再將發(fā)卡結(jié)構(gòu)連接到二元載體pCAMBIA35S-1301上,經(jīng)酶切檢測及測序分析,成功地構(gòu)建了含ACO基因發(fā)卡結(jié)構(gòu)的植物表達載體。
　　 2、郁金香組織培養(yǎng)的試驗研究
　　 以郁金香的鱗片、花莖、花托、花瓣、花藥和雌蕊為外植體,進行了系統(tǒng)地組織培養(yǎng)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),郁金香可以有直接器官發(fā)生和間接器官發(fā)生兩種途徑形成再生植株。通過研究,篩選出了適宜的培養(yǎng)基激

4、素配比,成功地獲得了郁金香組織培養(yǎng)再生植株。初代培養(yǎng)階段,以郁金香花莖、花托和雌蕊為最佳外植體選擇,污染率在8.6％以下,愈傷組織的誘導率高達72％～100％。適合郁金香的花莖、花托和雌蕊等外植體愈傷組織的誘導和增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基是Ms+0.5 mg·L-12,4-D,適合這些外植體不定芽的誘導和愈傷組織分化的培養(yǎng)基是Ms+O.2 mg·L-12,4-D+6.0 mg·L-1ZT。生根階段,最適培養(yǎng)基為1/2 Ms+1.0 mg·L-1N