玉米α-淀粉酶基因花粉特異表達(dá)載體構(gòu)建及愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、玉米是我國第一大糧食作物，作為工業(yè)原料、農(nóng)業(yè)飼料、口糧和種子在國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中占據(jù)舉足輕重的地位。但我國人口眾多，農(nóng)村勞動力極度緊缺，隨著飼料消費(fèi)和玉米深加工消費(fèi)的增長，愈發(fā)顯現(xiàn)出我國人均玉米占有量低，剛性需求卻越來越大的矛盾。不育系制種是世界范圍內(nèi)廣泛采用的提高玉米雜交種產(chǎn)量的重要手段。人們在研究雄性不育機(jī)理的過程中逐漸加深了對植物生殖發(fā)育分子機(jī)理的研究，使得利用基因工程創(chuàng)造雄性不育系為作物育種開辟了一條嶄新的道路。美國先鋒公司發(fā)明的

2、玉米SPT(Seed Production Technology)制種技術(shù)實(shí)現(xiàn)了核不育系的保持，不育系與保持系一系兩用，能夠方便有效區(qū)分可育株與不育株，選種時利用種子顏色差異可滿足全程機(jī)械操作，繁殖時只需隔離自交，雜交F1代皆為非轉(zhuǎn)基因種子，它使大規(guī)模安全利用雜種優(yōu)勢成為可能。
　　本課題組經(jīng)空間誘變獲得穩(wěn)定核不育系Sicau-ms，為使其能更快的應(yīng)用于核不育系育種，實(shí)現(xiàn)核不育系的保持，本研究借鑒SPT制種技術(shù)的成功經(jīng)驗(yàn)，利用重疊

3、PCR和酶切連接相結(jié)合的方法構(gòu)建出可以使花粉敗育的淀粉酶基因花粉特異表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將淀粉酶基因花粉特異表達(dá)載體轉(zhuǎn)化優(yōu)良自交系18-599R的愈傷組織。研究結(jié)果如下:
　　1.利用高保真酶KOD Fx，以B73葉片總DNA為模板擴(kuò)增花粉特異表達(dá)啟動子Pg(X66692)，造粉體信號肽bt1(NM_001112419)和苯磺胺代替物基因的終止子In2-1(NM_001111963)，以18-599R萌發(fā)種子的cDNA為模板

4、擴(kuò)增α-淀粉酶基因(NM_001156806)。通過目的片段回收測序，經(jīng)NCBI進(jìn)行序列比對，序列相似性分別為99％，100％，100％和95％。
　　2.利用降落重疊PCR(TD-SOE-PCR)方法將4個目的片段按啟動子Pg、信號肽bt1、α-淀粉酶基因、終止子In2-1的次序進(jìn)行連接。設(shè)計具有反向互補(bǔ)末端的引物，分別以含4個目的片段的質(zhì)粒為模板，用高保真酶KOD Fx擴(kuò)增出具有反向互補(bǔ)粘性末端的目的片段，且在啟動子Pg的5'

5、端和終止子In2-1的3'端分別引入酶切位點(diǎn)HindⅢ和EcoRⅠ。采用降落重疊PCR(TD-SOE-PCR)的方法使具有互補(bǔ)鏈的各個片段通過重疊鏈的延伸拼接起來。將拼接后的淀粉酶基因表達(dá)盒連入零背景載體pEASY-B-Z后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆進(jìn)行菌液擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒送往公司測序，經(jīng)NCBI序列比對證實(shí)連接產(chǎn)物連接順序正確無誤，且序列相似性達(dá)99％。
　　3.將淀粉酶基因表達(dá)盒成功連入植物表達(dá)載體CPB。用內(nèi)切酶HindⅢ和Ec

6、oRⅠ酶切連入了淀粉酶基因表達(dá)盒的零背景載體質(zhì)粒，回收淀粉酶基因表達(dá)盒。并用HindⅢ和EcoRⅠ酶切表達(dá)載體CPB的質(zhì)粒，獲得線性化載體。利用T4 DNA連接酶將二者進(jìn)行連接。成功連接后將淀粉酶基因特異表達(dá)載體進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，涂于抗kana的平板上，12-16h后挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)繁，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和HindⅢ37℃酶切過夜后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并以原始的CPB質(zhì)粒為陰性對照，以淀粉酶基因表達(dá)盒序列為陽性對照，鑒定所提單克隆

7、質(zhì)粒為陽性克隆。
　　4.以玉米優(yōu)良自交系18-599R胚性愈傷組織為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化目的表達(dá)載體。經(jīng)不同濃度basta（1.5mg/L、2.5mg/L和3mg/L）進(jìn)行3輪篩選后獲得抗性愈傷分化成苗植株數(shù)為17株。以再生植株的基因組DNA為模板，抗除草劑bar基因和淀粉酶基因盒的特異性序列引物進(jìn)行PCR，皆未擴(kuò)增出目的條帶，所得再生植株皆為假陽性苗，初步證實(shí)目的載體T-DNA區(qū)未整合到受體玉米自交系18-599R的基因